Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Preparazione di microsfere coniugate con antigene
- Seleziona tre diverse fiale di microsfere magnetiche con regioni di perline uniche, registrando l'ID della perlina e le informazioni sul lotto per ogni fiala utilizzata.
nota: I seguenti passaggi verranno seguiti per ogni regione di microsfere distinta. Le microsfere sono sensibili alla luce e devono essere protette dall'esposizione prolungata alla luce. Durante le fasi di lavaggio, fare attenzione a non disturbare le microsfere. In caso di disturbo, attendere una seconda separazione di 60 secondi.
- Agitare la microsfera per 60 s e sonicare per 5 minuti prima dell'uso per dissociare le perle aggregate.
- Trasferire 1,0 x 106 perle in provette da microcentrifuga a basso contenuto proteico da 1,5 mL.
- Inserire il tubo in un separatore magnetico e lasciare che la separazione avvenga per 60 s. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet del tallone.
- Rimuovere la provetta dal separatore magnetico, risospendere le perle con 100 μL di acqua di grado HPLC e agitare per 30 s. Riposizionare la provetta nel separatore magnetico per 60 s e successivamente rimuovere il surnatante. Ripetere questo protocollo di lavaggio due volte.
- Rimuovere la provetta dal separatore magnetico e risospendere le microsfere lavate in 90 μL di 100 mM di Fosfato di sodio monobasico, pH 6,2 (tampone di attivazione) a vortice per 30 s.
- Aggiungere 10 μL di 50 mg/mL di Sulfo-NHS (diluito con tampone di attivazione) alle microsfere e agitare delicatamente per 10 s. Aggiungere 10 μL di soluzione EDC da 50 mg/mL (diluita con tampone di attivazione) e agitare delicatamente per 10 s. Incubare le microsfere per 20 minuti a temperatura ambiente (RT) con un vortice delicato ogni 10 minuti.
- Ripetere i passaggi di lavaggio 1,4-1,5 con 50 mM MES, pH 5,0 (tampone di accoppiamento) al posto di acqua di grado LC/MS per un totale di due lavaggi.
- Rimuovere la provetta dal separatore magnetico e risospendere le perle con 100 μL di tampone di accoppiamento a vortice per 30 s seguito immediatamente dall'aggiunta della quantità di proteine desiderata.
- Portare il volume totale a 150 μl con il tampone di accoppiamento. Miscelare la reazione di accoppiamento a vortice per 30 s e incubare per 2 ore a rotazione a RT.
nota: Per i saggi qui definiti, le coniugazioni sono state eseguite con le seguenti concentrazioni proteiche: Spike S1: 5 μg; Nucleocapside: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.
- Ripetere la fase di lavaggio 1.4 con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)-1% albumina sierica di capra, 0,01% di polisorbato-20 (tampone di estinzione) al posto di acqua di grado LC/MS per un totale di due lavaggi. Risospendere le microsfere lavate in 100 μL di tampone di quench contenente lo 0,05% di azoturo di sodio a vortice per 30 s.
nota: Lasciare che le perle si templino completamente per almeno 6 ore prima di procedere a qualsiasi altra procedura.
- Conta il numero di microsfere recuperate utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro. Registrare la concentrazione di perline osservata.
- Refrigerare le microsfere accoppiate a 4 °C al buio.
2. Procedure
- Prestazioni del test (protocollo di base)
- Risospendere le microsfere accoppiate a vortice per 30 s e sonicare per ~60-90 s.
- Rimuovere la quantità necessaria di ciascun colloide di perle dalla rispettiva provetta e combinare i colloidi di perle in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Inserire il tubo in un separatore magnetico e lasciare che la separazione avvenga per 60 secondi. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet del tallone.
- Rimuovere le perle dal separatore, risospendere le perle con 100 μL di PBS-1% di albumina sierica bovina, 0,01% di polisorbato-20 (tampone di saggio) e vorticare per 30 s. Posizionare la provetta in un separatore magnetico e lasciare che la separazione avvenga per 60 s. Ripetere questo protocollo di lavaggio (ad esempio, i passaggi 2.1.3-2.1.4) due volte.
- Regolare la concentrazione della miscela di microsfere di lavoro a 3 plessi aggiungendo un volume appropriato di tampone per il saggio per generare una concentrazione finale di 100 microsfere per 1 μl per ciascun target.
- Aliquotare 12,5 μl della miscela di microsfere preparata al punto 2.1.5 in ciascun pozzetto di una piastra a 384 pozzetti o 25 μl in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Diluire i campioni di plasma/siero 500 volte nel tampone di analisi. Preparare i campioni standard in base alla titolazione desiderata.
- Aggiungere 12,5 μl di tampone per il saggio come campione bianco e aggiungere ciascuno dei campioni diluiti o standard in ciascun pozzetto designato di una piastra per campioni da 384 pozzetti o 25 μl del campione o dello standard diluito in bianco in ciascun pozzetto di una piastra per campioni da 96 pozzetti.
- Coprire la piastra con un sigillo di alluminio o un foglio di alluminio e incubare per 1 ora a RT su un agitatore per piastre impostato a 700 giri/min.
nota: Lo schema delle curve di diluizione è riportato nella Tabella 1.
- Preparare una soluzione di anticorpi anti-rilevamento umano (soluzioni di anticorpi secondari) a 4 μg/mL con tampone di saggio come specificato al punto 2.1.11.
- Preparare anticorpi di rilevazione di IgM anti-umane di capra, coniugate con anticorpi di rilevazione Super Bright 436 (SB)/IgA anti-umana di capra, ficoeritrina (PE) a 4 μg/mL; o anti-IgM anti-umane di capra, SB coniugato/IgG anti-umana di capra, anticorpi coniugati PE a 4 μg/mL.
nota: Per un formato di piastra a 384 pozzetti, sono necessari 12,5 μL/pozzetto della soluzione di anticorpo secondario preparata e per un formato di piastra a 96 pozzetti, sono necessari 25 μL/pozzetto.
- Posizionare la piastra su un separatore magnetico, lavarla rapidamente e capovolgerla con forza su un contenitore a rischio biologico per rimuovere il liquido dai pozzetti. Con la piastra ancora capovolta, picchiettare con forza la piastra contro un batuffolo di carta spessa.
- Lavare ogni pozzetto con 100 μl di tampone per saggio e rimuovere il liquido mediante inversione forzata su un contenitore a rischio biologico, come descritto in precedenza. Ripetere questi passaggi (2.1.12-2.1.13) per un totale di due lavaggi. Gettare tutti i batuffoli di carta usati in un contenitore a rischio biologico.
- Aggiungere 12,5 μl della soluzione di lavoro dell'anticorpo secondario a ciascun pozzetto di una piastra a 384 pozzetti o 25 μl a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio o un foglio di alluminio e incubare per 30 minuti a RT su un agitatore per piastre impostato a 700 giri/min.
- Ripetere i passaggi di lavaggio 2.1.12-2.1.13.
- Aggiungere 75 μl di tampone per saggi in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti o 100 μl in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio o un foglio di alluminio e incubare per 5 minuti a RT su un agitatore per piastre impostato a 700 giri/min.
- Analizza 60 μl tramite l'analizzatore dello strumento secondo il manuale del sistema.
Tabella 1: Serie di diluizione per curve standard: Tabella dei fattori di diluizione utilizzati per le curve standard per il sierotipo IgG; presentata come curva di diluizione seriale 1:5 a 7 punti a partire da 1 μg/mL per α-Spike S1 e α-Nucleocapside e 5 μg/mL per gli anticorpi α-Membrana.
| Numero standard | Serie di diluizione | Anti-spike S1 o N (μg/mL) | Anti-membrana (μg/mL) |
| vuoto | vuoto | - | - |
| 1 | STD7 1:1 | 1 | 5 |
| numero arabo | STD6 1:5 | 0,2 | 1 |
| 3 | STD5 1:25 | 0,04 | 0,2 |
| 4 | STD4 1:125 | 0,008 | 0,04 |
| 5 | STD3 1:625 | 0,0016 | 0,008 |
| 6 | STD2 1:3125 | 0,00032 | 0,0016 |
| 7 | STD1 1:15625 | 0,000064 | 0,00032 |
