Saggio Immunobead Multianalita: una tecnica di immunodosaggio basata sul flusso per la rilevazione concomitante di più sottotipi di anticorpi in un campione di siero umano

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Preparazione di microsfere coniugate con antigene

1. Seleziona tre diverse fiale di microsfere magnetiche con regioni di perline uniche, registrando l'ID della perlina e le informazioni sul lotto per ogni fiala utilizzata.
   nota: I seguenti passaggi verranno seguiti per ogni regione di microsfere distinta. Le microsfere sono sensibili alla luce e devono essere protette dall'esposizione prolungata alla luce. Durante le fasi di lavaggio, fare attenzione a non disturbare le microsfere. In caso di disturbo, attendere una seconda separazione di 60 secondi.
2. Agitare la microsfera per 60 s e sonicare per 5 minuti prima dell'uso per dissociare le perle aggregate.
3. Trasferire 1,0 x 10⁶ perle in provette da microcentrifuga a basso contenuto proteico da 1,5 mL.
4. Inserire il tubo in un separatore magnetico e lasciare che la separazione avvenga per 60 s. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet del tallone.
5. Rimuovere la provetta dal separatore magnetico, risospendere le perle con 100 μL di acqua di grado HPLC e agitare per 30 s. Riposizionare la provetta nel separatore magnetico per 60 s e successivamente rimuovere il surnatante. Ripetere questo protocollo di lavaggio due volte.
6. Rimuovere la provetta dal separatore magnetico e risospendere le microsfere lavate in 90 μL di 100 mM di Fosfato di sodio monobasico, pH 6,2 (tampone di attivazione) a vortice per 30 s.
7. Aggiungere 10 μL di 50 mg/mL di Sulfo-NHS (diluito con tampone di attivazione) alle microsfere e agitare delicatamente per 10 s. Aggiungere 10 μL di soluzione EDC da 50 mg/mL (diluita con tampone di attivazione) e agitare delicatamente per 10 s. Incubare le microsfere per 20 minuti a temperatura ambiente (RT) con un vortice delicato ogni 10 minuti.
8. Ripetere i passaggi di lavaggio 1,4-1,5 con 50 mM MES, pH 5,0 (tampone di accoppiamento) al posto di acqua di grado LC/MS per un totale di due lavaggi.
9. Rimuovere la provetta dal separatore magnetico e risospendere le perle con 100 μL di tampone di accoppiamento a vortice per 30 s seguito immediatamente dall'aggiunta della quantità di proteine desiderata.
10. Portare il volume totale a 150 μl con il tampone di accoppiamento. Miscelare la reazione di accoppiamento a vortice per 30 s e incubare per 2 ore a rotazione a RT.
    nota: Per i saggi qui definiti, le coniugazioni sono state eseguite con le seguenti concentrazioni proteiche: Spike S1: 5 μg; Nucleocapside: 5 μg; Membrana: 12,5 μg.
11. Ripetere la fase di lavaggio 1.4 con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)-1% albumina sierica di capra, 0,01% di polisorbato-20 (tampone di estinzione) al posto di acqua di grado LC/MS per un totale di due lavaggi. Risospendere le microsfere lavate in 100 μL di tampone di quench contenente lo 0,05% di azoturo di sodio a vortice per 30 s.
    nota: Lasciare che le perle si templino completamente per almeno 6 ore prima di procedere a qualsiasi altra procedura.
12. Conta il numero di microsfere recuperate utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro. Registrare la concentrazione di perline osservata.
13. Refrigerare le microsfere accoppiate a 4 °C al buio.

2. Procedure

1. Prestazioni del test (protocollo di base)
   1. Risospendere le microsfere accoppiate a vortice per 30 s e sonicare per ~60-90 s.
   2. Rimuovere la quantità necessaria di ciascun colloide di perle dalla rispettiva provetta e combinare i colloidi di perle in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
   3. Inserire il tubo in un separatore magnetico e lasciare che la separazione avvenga per 60 secondi. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet del tallone.
   4. Rimuovere le perle dal separatore, risospendere le perle con 100 μL di PBS-1% di albumina sierica bovina, 0,01% di polisorbato-20 (tampone di saggio) e vorticare per 30 s. Posizionare la provetta in un separatore magnetico e lasciare che la separazione avvenga per 60 s. Ripetere questo protocollo di lavaggio (ad esempio, i passaggi 2.1.3-2.1.4) due volte.
   5. Regolare la concentrazione della miscela di microsfere di lavoro a 3 plessi aggiungendo un volume appropriato di tampone per il saggio per generare una concentrazione finale di 100 microsfere per 1 μl per ciascun target.
   6. Aliquotare 12,5 μl della miscela di microsfere preparata al punto 2.1.5 in ciascun pozzetto di una piastra a 384 pozzetti o 25 μl in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
   7. Diluire i campioni di plasma/siero 500 volte nel tampone di analisi. Preparare i campioni standard in base alla titolazione desiderata.
   8. Aggiungere 12,5 μl di tampone per il saggio come campione bianco e aggiungere ciascuno dei campioni diluiti o standard in ciascun pozzetto designato di una piastra per campioni da 384 pozzetti o 25 μl del campione o dello standard diluito in bianco in ciascun pozzetto di una piastra per campioni da 96 pozzetti.
   9. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio o un foglio di alluminio e incubare per 1 ora a RT su un agitatore per piastre impostato a 700 giri/min.
      nota: Lo schema delle curve di diluizione è riportato nella Tabella 1.
   10. Preparare una soluzione di anticorpi anti-rilevamento umano (soluzioni di anticorpi secondari) a 4 μg/mL con tampone di saggio come specificato al punto 2.1.11.
   11. Preparare anticorpi di rilevazione di IgM anti-umane di capra, coniugate con anticorpi di rilevazione Super Bright 436 (SB)/IgA anti-umana di capra, ficoeritrina (PE) a 4 μg/mL; o anti-IgM anti-umane di capra, SB coniugato/IgG anti-umana di capra, anticorpi coniugati PE a 4 μg/mL.
       nota: Per un formato di piastra a 384 pozzetti, sono necessari 12,5 μL/pozzetto della soluzione di anticorpo secondario preparata e per un formato di piastra a 96 pozzetti, sono necessari 25 μL/pozzetto.
   12. Posizionare la piastra su un separatore magnetico, lavarla rapidamente e capovolgerla con forza su un contenitore a rischio biologico per rimuovere il liquido dai pozzetti. Con la piastra ancora capovolta, picchiettare con forza la piastra contro un batuffolo di carta spessa.
   13. Lavare ogni pozzetto con 100 μl di tampone per saggio e rimuovere il liquido mediante inversione forzata su un contenitore a rischio biologico, come descritto in precedenza. Ripetere questi passaggi (2.1.12-2.1.13) per un totale di due lavaggi. Gettare tutti i batuffoli di carta usati in un contenitore a rischio biologico.
   14. Aggiungere 12,5 μl della soluzione di lavoro dell'anticorpo secondario a ciascun pozzetto di una piastra a 384 pozzetti o 25 μl a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio o un foglio di alluminio e incubare per 30 minuti a RT su un agitatore per piastre impostato a 700 giri/min.
   15. Ripetere i passaggi di lavaggio 2.1.12-2.1.13.
   16. Aggiungere 75 μl di tampone per saggi in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti o 100 μl in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Coprire la piastra con un sigillo di alluminio o un foglio di alluminio e incubare per 5 minuti a RT su un agitatore per piastre impostato a 700 giri/min.
   17. Analizza 60 μl tramite l'analizzatore dello strumento secondo il manuale del sistema.

Tabella 1: Serie di diluizione per curve standard: Tabella dei fattori di diluizione utilizzati per le curve standard per il sierotipo IgG; presentata come curva di diluizione seriale 1:5 a 7 punti a partire da 1 μg/mL per α-Spike S1 e α-Nucleocapside e 5 μg/mL per gli anticorpi α-Membrana.