$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Collezione di organismi
- Raccogli anemone di mare A. dowii.
NOTA: Qui, gli organismi sono stati raccolti durante i periodi di bassa marea nella zona intertidale al largo della costa di Ensenada Baja, California, Messico (Figura 1A, B).
- Trasportare gli organismi in laboratorio in contenitori con acqua di mare (Figura 1C).
- In laboratorio, pulire a mano gli organismi con acqua distillata per rimuovere le grandi particelle di substrato che aderiscono al corpo.
- Congelare immediatamente gli organismi a -80 °C in un ultra-congelatore per 72 ore.
- Porre gli organismi in appositi bicchieri per la liofilizzazione, con condizioni di liofilizzazione di -20 °C, 0,015 psi, per 48 h.
- Conservare gli organismi liofilizzati a -20 °C fino al momento dell'uso.
2. Idratazione dei tessuti
- Ricostituire 20 g di peso secco di organismi liofilizzati con 60 mL (1/3 p/v) di 50 mM di tampone fosfato di sodio, pH 7,5 e 1 compressa di cocktail di inibitori (Tabella dei materiali).
- In un agitatore magnetico, agitare continuamente il campione a ~800 giri/min, 4 °C, per 12 ore.
3. Rilascio di tossine
- Per indurre la lisi cellulare e la secrezione di nematocisti, congelare il campione a -20 °C per 12 ore, quindi immergere il contenitore in acqua a temperatura ambiente (RT) fino a quando non si scongela fino al 90%. Ripetere questa procedura tre volte.
nota: Il campione non si scongela al 100%; è fondamentale mantenere il campione a ~4 °C per prevenire la degradazione delle proteine.
- Osservare la nematocisti scaricata al microscopio confocale. Prelevare 10 μl di campione su un vetrino e posizionarvi sopra un vetrino coprioggetti. Osservare al microscopio confocale con ingrandimento 100x e 60x. Qui non era necessario un colorante.
- Elaborare le immagini acquisite nel microscopio confocale nel software ImageJ (versione 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).
- Se il tubulo all'interno della nematocisti si srotola e si trova all'esterno, le nematocisti vengono scaricate; quindi, continua con il passaggio successivo. In caso contrario, eseguire solo un altro ciclo di congelamento-disgelo.
- Per chiarificare l'estratto, centrifugare il campione a 25.400 x g per 40 min, 4 °C, recuperare il surnatante e centrifugarlo nuovamente. Ripeti questo passaggio 3-4 volte.
- Recuperare il surnatante e scartare il pellet. Il surnatante o estratto grezzo contiene i componenti del veleno (tossine) e altre molecole cellulari, come lipidi, carboidrati e acidi nucleici.
4. Quantificazione delle proteine totali
- Determinare la concentrazione proteica dell'estratto grezzo utilizzando un kit di test colorimetrico Bradford commerciale (Tabella dei materiali).
- Diluire il reagente colorante (una parte di colorante con quattro parti di acqua distillata).
- Preparare la soluzione di albumina sierica bovina (BSA) frazione V (Tabella dei materiali) alla concentrazione di 1 mg/mL in tampone fosfato (50 mM di fosfato di sodio, pH 7,5).
- Preparare le soluzioni elencate nella Tabella 1 in triplice copia.
- Mescolare energicamente ogni soluzione in uno shaker per 4 s.
- Incubare i campioni per 5 minuti a RT, senza agitare.
- Misura dell'assorbanza (AU) a 595 nm.
- Tracciare le medie delle assorbanze BSA del campione (AU vs. concentrazione proteica) e determinare l'equazione del grafico (Equazione 1).
dove y è l'assorbanza, m è la pendenza della linea, x è la concentrazione proteica e b è l'intercetta y. Per calcolare la concentrazione dell'estratto grezzo, risolvere per x come segue:
5. Determina la complessità del veleno polipeptidico
- Assemblare il contenitore di vetro per l'elettroforesi verticale su gel secondo il manuale.
- Preparare la miscela di acrilammide (30%): 29,2 g di acrilammide, 0,8 g di bis-acrilammide, il volume finale di 100 ml. Filtrare la soluzione utilizzando una membrana da 0,45 μm. Conservare la soluzione in un flacone scuro a 4 °C. Quindi, preparare la miscela per il gel risolutivo (Tabella 2).
- Il gel SDS-PAGE è costituito da un gel risolutivo e da un gel impilabile. Preparare i gel secondo i volumi di soluzione definiti nella Tabella 2. Durante la preparazione, assicurarsi di mantenere ogni miscela a 4 °C per ridurre il tempo di polimerizzazione.
nota: Il volume di ogni miscela varia a seconda della marca dell'attrezzatura utilizzata; per questo protocollo, i volumi corrispondono alla preparazione di gel di acrilammide al 15%, spessore 0,75 mm, per una camera di elettroforesi verticale (Tabella dei materiali).
- Dopo che l'acrilammide si è polimerizzata, ~10 minuti, aggiungere la miscela di gel impilabile.
- Preparare la miscela per il gel da impilare, aggiungerla immediatamente alle lastre di vetro e posizionare un pettine per formare i pozzetti per il caricamento dei campioni.
- Una volta che il gel da impilare si è polimerizzato (~15 min), rimuovere il pettine e posizionare il contenitore di vetro in una camera per l'elettroforesi verticale.
- Inserire 200 mL di tampone elettrodico (0,25 M Tris, 0,192 M glicina, 0,1% SDS) nella camera di elettroforesi.
- Analizzare l'estratto grezzo: Mescolare 30 μg di estratto grezzo con 5 μL di tampone di carico proteico (25% glicerolo, 15% sodio dodecil solfato, 25% 2-mercaptoetanolo, 0,125 mM Tris pH 7, blu bromofenolo 0,1 mg/mL) per denaturare le proteine. Il volume finale deve essere di <50 μl.
- Riscaldare a 90 °C per 5 minuti, raffreddare e centrifugare per 3 s a 1.400 x g. 10. Caricare i campioni nei pozzetti del gel da impilare. Caricare una scala di pesi molecolari standard.
- Caricare i campioni nei pozzetti del gel di impilamento. Caricare una scala di pesi molecolari standard.
- Eseguire l'elettroforesi a 25 mA costanti per 1 ora e 30 minuti.
- Rimuovere i contenitori di vetro dalla camera di elettroforesi per procedere con la colorazione delle proteine del gel.
6. Colorazione delle proteine
- Sciacquare il gel in 50 ml di acqua distillata per rimuovere i detriti dall'elettrodo tampone.
- Scartare l'acqua.
- Per evitare la diffusione delle proteine del gel, aggiungere la soluzione di fissazione (60 ml di etanolo, 20 ml di acido acetico e 20 ml di acqua distillata, volume finale 100 ml). Incubare a RT per 40 min con agitazione a 80 rpm. Decantare la soluzione.
- Aggiungere la soluzione di reticolazione proteica (15 mL di etanolo, 0,25 mL di glutaraldeide, 50 mL di acqua distillata, volume finale 65,25 mL) e incubare per 30 minuti a RT con agitazione a 80 giri/min. Rimuovere la soluzione.
- Lavare il gel con 100 ml di acqua distillata per 5 minuti e rimuovere l'acqua. Ripetere questa procedura quattro volte.
- Eseguire la colorazione delle proteine con 50 mL di soluzione filtrata Coomassie brilliant blue R-250 (40% metanolo, 10% acido acetico, 50% acqua distillata, 0,1% colorante, volume finale 100 mL), agitando a 60 giri/min in un oscillatore rotante da laboratorio a RT per 15 min.
- Recupera la soluzione, che può essere utilizzata per colorare altri gel.
- Per eliminare il colorante in eccesso, aggiungere una soluzione decolorante (40 mL di metanolo, 10 mL di acido acetico, 50 mL di acqua distillata). Continuare a mescolare (80 giri/min) a RT fino a quando le bande (proteine colorate) non vengono visualizzate.
- Conservare il gel in 50 ml di acqua distillata e scansionare l'immagine in un sistema di documentazione Gel.
7. Dosaggio della fosfolipasi
- Lavare un uovo di gallina con l'1% di SDS in acqua distillata.
- Separare il tuorlo dall'albume in condizioni sterili.
- Preparare 50 mL di soluzione di NaCl allo 0,86% e filtrare con un filtro da 0,22 μm. Quindi, preparare la soluzione A: aggiungere 12 ml di tuorlo d'uovo e 36 ml di soluzione di NaCl allo 0,86%.
- Preparare la soluzione B: Miscelare 300 mg di agarosio in 50 mL di tampone (50 mM Tris, pH 7,5), filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Scaldare la soluzione nel microonde fino a ebollizione. Raffreddare in acqua tiepida fino a raggiungere i 43-45°C.
- Preparare la soluzione C: Preparare 10 mM di CaCl2 e filtrarlo con un filtro da 0,22 μm.
- Preparare la soluzione D: 10 mg di rodamina 6G in 1 mL di acqua distillata.
- In condizioni sterili (cappa a flusso laminare), aggiungere 500 μL di soluzioni A e C alla soluzione B e 100 μL di soluzione D, mescolare e versare 25 mL in ciascuna piastra di Petri (90 x 15 mm).
- Attendere che la soluzione si solidifichi in condizioni sterili (30 min).
- Fare dei pozzetti (~2-3 mm di diametro) con un tubo sottile.
- Aggiungere un totale di 20 μL di tampone fosfato (controllo negativo) in un pozzetto e 20 μL di una fosfolipasi determinata (controllo positivo) in un altro pozzetto.
- Porre diverse quantità di proteina dell'estratto grezzo, 5, 15, 25, 35, 45 μg, nei pozzetti rimanenti, ciascuno in un volume finale di 20 μl.
- Attendere che l'agar adsorba tutti i campioni (30 min).
- Incubare a 37 °C per 20 ore.
- Se si forma un alone intorno al pozzo, ciò indica l'attività della fosfolipasi. Misurare l'alone formato con un calibro a corsoio.
nota: Esegui l'esperimento in triplice copia (passaggi da 7.1 a 7.14).
