1. Fabbricazione di timbri in polidimetilsilossano (PDMS)
- Disegna una serie di anelli su microscala utilizzando il software CAD, con un diametro interno di 250 μm e un diametro esterno di 450 μm. Il modello utilizzato in questo protocollo è un array 10 x 10 con una distanza di 850 μm tra gli anelli.
- Stampa una maschera di trasparenza del modello alla risoluzione desiderata utilizzando il servizio di stampa di maschere di un'azienda di microfabbricazione (vedi Tabella dei materiali).
nota: È stato dimostrato che le dimensioni fornite dell'anello funzionano per molti tipi di celle.
- Condurre la fotolitografia ultravioletta (UV) utilizzando la maschera contenente le caratteristiche desiderate per creare uno stampo fotoresist negativo (come SU-8).
- Coprire un wafer di silicone rivestito di fotoresist con la maschera di trasparenza fabbricata nei passaggi 1.1-1.2.
- Su un allineatore a contatto UV, polimerizzare il fotoresist sotto le regioni trasparenti della maschera mediante luce UV.
nota: Dopo un ulteriore lavaggio e sviluppo, viene fabbricato lo stampo master con le caratteristiche desiderate. I dettagli operativi dipendono dall'attrezzatura specifica utilizzata.
- Preparare i prepolimeri elastomerici PDMS mescolandoli con il suo agente indurente in un rapporto 10:1 e quindi gettare la miscela sullo stampo in una capsula di Petri.
- Porre la pirofila in una camera a vuoto per 30 minuti per eliminare le bolle d'aria nel PDMS e cuocere in forno a 60 °C per almeno 2 ore.
- Dopo l'indurimento completo del PDMS, tagliare gli array di modelli in stamps.
nota: I timbri più spessi (circa 1 cm) possono essere preferiti a causa della facilità di manipolazione nelle fasi successive della stampa a microcontatto.
2. Rivestimento di vetrini
- Pulire i vetrini. Immergere i vetrini in un bagno di etanolo al 100%, sonicare per 5 minuti e poi risciacquare con acqua.
- Ripetere questo passaggio prima con acetone, poi con isopropanolo, quindi essiccazione in un flusso di azoto.
- Utilizzare un'apparecchiatura di evaporazione a fascio di elettroni (E-beam) per rivestire strati di titanio e oro su vetrini.
nota: Per lo strato di titanio, lo spessore desiderato è di 15 Å (1 Å = 10-10 m). Per lo strato d'oro, lo spessore desiderato è di 150 Å. Rivestire prima il titanio e poi l'oro, poiché lo strato di titanio funge da adesivo tra l'oro e il vetrino.
- Posizionare i vetrini puliti nella camera di evaporazione e inserire i crogioli in oro e titanio sotto le persiane.
- Pompare la camera per creare un vuoto inferiore a 10-5 Pa prima di fondere i metalli. Focalizzare il fascio di elettroni sul metallo e regolare la potenza in modo che la velocità di deposito sia appropriata per controllare lo spessore di deposizione.
- Aprire l'otturatore per avviare la deposizione del metallo. Chiudere la serranda quando viene raggiunto lo spessore desiderato.
- Commutazione dei crogioli tra l'evaporazione sequenziale di due metalli.
- Attendi che i crogioli si raffreddino come richiesto dall'attrezzatura, sfiati la camera ed estrai i vetrini rivestiti d'oro.
- Pompare nuovamente la camera per la manutenzione dell'apparecchiatura.
nota: I dettagli operativi possono dipendere da uno specifico evaporatore E-beam. Avere un tasso di deposito di titanio basso e ben controllato è importante. Uno spesso strato di titanio spesso porta a una scarsa visibilità, soprattutto per l'imaging a fluorescenza delle cellule. Dopo il rivestimento, i vetrini in titanio/oro possono essere conservati in una camera a vuoto asciutta a temperatura ambiente per almeno 1 mese.
3. Stampa a microcontatto
- Se lo si desidera, tagliare il vetrino rivestito in titanio/oro in pezzi più piccoli. Per un'applicazione tipica si consiglia una forma quadrata di 12 mm x 12 mm (Figura 1B).
- Usa un tagliavetro per far scorrere la superficie per lasciare una traccia ammaccata, quindi tieni il vetrino su entrambi i lati e piega l'ammaccatura per romperla in piccoli quarti. Evitare di toccare la superficie rivestita con gold.
nota: Per determinare visivamente su quale lato del vetro si trova la superficie rivestita in caso di ribaltamento accidentale, confrontare il riflesso della luce su entrambi i lati. La superficie ricoperta d'oro mostrerà un riflesso più luminoso, mentre il lato non rivestito avrà un riflesso più debole (dallo strato di titanio sull'altro lato del vetro). Un modo alternativo è osservare i bordi della slitta e il lato del rivestimento può essere determinato dalla superficie di taglio verticale.
- Pulire i vetrini immergendoli in etanolo al 100% in una capsula di Petri con il lato dorato rivolto verso l'alto su uno shaker orbitale per almeno 10 minuti. Aspirare l'etanolo, quindi asciugare ogni vetrino soffiando con un flusso di azoto.
- Pulire i timbri PDMS con acqua saponata e poi etanolo al 100%. Asciugare i timbri con azoto gassoso.
- Preparare 2 mM di soluzione di ottadecanetiolo (C18) sciogliendo 5,74 mg di polvere di C18 in 10 mL di etanolo al 100%.
nota: Sigillare e conservare la soluzione di C18 a temperatura ambiente. I modelli di stampa con C18 creano un monostrato adesivo autoassemblato per il quale la fibronectina e le cellule si attaccheranno preferenzialmente.
- Immergere i timbri PDMS in soluzione C18 con la superficie modellata rivolta verso il basso per 10 s e asciugare delicatamente con azoto gassoso per 60 s.
nota: Durante l'asciugatura, posizionare prima il getto lontano dal timbro (circa 1 m) fino a quando la maggior parte del liquido non è evaporato, quindi avvicinare lentamente il getto per asciugare completamente il timbro. Questo per evitare che la soluzione di C18 venga soffiata via invece di asciugarsi sul timbro.
- Appoggiare il timbro a faccia in giù sui vetrini d'oro per 60 s prima di rimuoverlo.
- Per garantire una corretta timbratura, picchiettare delicatamente le pinzette sui timbri per trasferire correttamente i motivi. Non spingere troppo forte verso il basso e il peso delle pinzette è in genere sufficiente.
nota: L'ispezione visiva del timbro durante la maschiatura assicurerà che il timbro e il vetrino siano entrati in contatto in modo uniforme.
- Preparare le camere di umidità.
- Pipettare 1 mL di etanolo al 70% in un coperchio della capsula di Petri capovolta e stendere un pezzo di parafilm per coprire la superficie (coperto rivolto verso l'alto).
- Usa le pinzette per sollevare, stendere il parafilm per assicurarti che non ci siano bolle d'aria e rimuovere l'etanolo in eccesso se necessario.
- Preparare 2 mM di soluzione HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3): Diluire 5 μL di soluzione madre in 5 mL di etanolo al 100%.
nota: La soluzione di EG3 diluita può essere sigillata e conservata a 4 °C, mentre il brodo di EG3 non diluito deve essere conservato a -20 °C. Il trattamento EG3 viene utilizzato per rendere la regione di vetro senza C18 non adesiva alle cellule.
- Micropipetta 40 μL di goccioline di EG3 per ogni quarto di vetro scivolano sul parafilm nella camera di umidità, lasciando uno spazio sufficiente tra le goccioline per tenere conto della spaziatura dei vetrini d'oro.
- Usa le pinzette per posizionare i vetrini dorati stampati C18 a faccia in giù sulle goccioline e assicurati che non ci siano bolle sotto i vetrini. Spingere delicatamente i vetrini insieme senza sollevarli per ridurre al minimo l'evaporazione.
nota: Posizionare un bordo del vetrino verso il basso vicino alla gocciolina, quindi abbassare lentamente l'altra estremità del vetrino verso il basso. Se è presente una bolla, spingere il vetrino d'oro senza sollevarlo fino a quando la bolla non è più presente.
- Sigillare ermeticamente la capsula di Petri con parafilm e lasciarla a temperatura ambiente per almeno 3 h.
nota: Se si desidera un'incubazione prolungata, sigillare due volte la capsula di Petri e lasciarla per un massimo di 24 ore.
- In una cabina di biosicurezza, posizionare i vetrini d'oro a faccia in su in una capsula di Petri, immergere e sciacquare 3 volte in etanolo al 70% per rimuovere l'EG3, quindi lasciare in etanolo per 10 minuti per la sterilizzazione.
- Aspirare l'etanolo e sostituirlo con PBS sterile.
- Preparare un'altra camera di umidità come descritto al punto 3.9, con PBS al posto dell'etanolo.
nota: A causa della differenza di tensione superficiale, è più facile aggiungere prima 4-5 ml di PBS per stendere il parafilm e rimuovere le bolle, quindi aspirare l'eccesso.
- Preparare la soluzione di fibronectina da 50 μg/mL (altre proteine, se lo si desidera) in PBS sterile e micropipettare goccioline da 50 μL di soluzione di fibronectina per ogni quarto di vetrino sul parafilm, lasciando un po' di spazio tra le goccioline.
nota: Il rivestimento di fibronectina facilita l'adesione delle cellule alle superfici modellate.
- Usa una pinzetta per wafer per posizionare i vetrini a faccia in giù sulle goccioline e assicurati che non ci siano bolle sotto i vetrini. Spingere delicatamente le guide insieme senza sollevarle.
nota: Per maneggiare i vetrini si consigliano pinzette per vetrini o pinzette per wafer con punte larghe e diritte.
- Lasciare la capsula di Petri nella cabina di biosicurezza per 30 minuti.
- Dopo 30 minuti, posizionare i vetrini dorati a faccia in su in PBS dopo aver risciacquato per 3 volte.
nota: I vetrini con pattern di fibronectina possono essere conservati in PBS a 4 °C per circa un mese.
4. Semina di cellule su vetrini micromodellati
- Riscaldare il terreno di coltura cellulare e la tripsina in un bagno d'acqua a 37 °C.
nota: La seguente descrizione della sottocoltura è per le cellule NIH/3T3. Le condizioni di coltura possono variare a seconda del tipo di cellula.
- (Opzionale) Immergere i vetrini modellati in terreni di coltura in una piastra a 12 pozzetti, riscaldarli fino a 37 °C in un incubatore prima della tripsinizzazione delle cellule per un migliore fissaggio delle cellule.
- Tripsinizzare le cellule, neutralizzarle con terreni contenenti FBS, centrifugare a 100 x g per 3 minuti e quindi risospendere mescolando bene con terreni freschi.
nota: Assicurati che le cellule siano completamente dissociate l'una dall'altra.
- Contare le cellule, diluirle a 200.000 cellule/mL e aggiungere 0,5 mL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto contenente un vetrino d'oro.
- Agitare delicatamente la piastra a pozzetti alcune volte per una semina uniforme delle cellule e conservarla in un'incubatrice per 15 minuti per consentire l'adesione delle cellule.
- Dopo 15 minuti, controllare l'attacco delle cellule al microscopio. Se necessario, concedete più tempo.
nota: Le celle attaccate si diffonderanno sulla superficie con filopodio visibile o appiattimento e non si sposteranno dalla superficie quando la piastra del pozzetto viene picchiettata o spostata delicatamente.
- Aspirare il terreno contenente le cellule non attaccate da ciascun pozzetto e aggiungere 1 mL di terreno di coltura. Per il trattamento farmacologico, integrare ulteriori reagenti ai terreni di coltura in questa fase.
- Coltivare le cellule nell'incubatore per 24 ore e controllare la confluenza per determinare se si è formata la chiralità.
nota: Per la maggior parte dei tipi di cellule si raccomanda una confluenza superiore al 75% e un'eccessiva confluenza può influenzare la caratterizzazione della chiralità.
5. Raccolta di immagini
- Fissa le celle alla confluenza.
- Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a pozzetti e risciacquare una volta con PBS.
- Aggiungere una soluzione di paraformaldeide al 4%, incubare a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi risciacquare 3 volte con PBS.
NOTA: Se la fissazione modifica in modo significativo la morfologia cellulare, si consiglia l'imaging prima della fissazione
- Utilizzare un microscopio a contrasto di fase con funzionalità fotocamera, visualizzare ogni anello sui vetrini ad alta risoluzione (l'obiettivo dell'oggetto 10x è sufficiente per l'analisi).
6. Caratterizzazione della chiralità cellulare (Figura 2)
- Scarica i file di codice MATLAB per la caratterizzazione della chiralità.
- Aggiungi la cartella del codice e le sottocartelle (con all'interno la casella degli strumenti delle statistiche circolari) al percorso MATLAB e apri il file "ROI_selection.m". Nella riga 4, modificare la directory nella cartella dati desiderata (per gli utenti Windows, passare da "/" a "\" nelle righe 4 e 5).
- Cambia la dimensione dell'immagine nella riga 14, con le prime due cifre che rappresentano la dimensione del cerchio interno dell'anello mentre le altre due rappresentano l'esterno.
nota: Assicurati che le dimensioni di tutte le immagini in una cartella da analizzare siano identiche.
- Fare clic sul pulsante Esegui per eseguire il codice MATLAB "ROI_selection.m" per determinare la regione di interesse (ROI) nelle immagini a contrasto di fase.
- Trascinare manualmente il quadrato di selezione per adattarlo all'anello, quindi fare doppio clic sull'immagine per confermare la selezione.
- Ripeti questo passaggio per ogni immagine nella cartella (l'immagine successiva apparirà automaticamente dopo aver confermato la selezione del ROI di un'immagine precedente); verrà generato un file ".mat" per memorizzare le informazioni sul ROI per ogni immagine.
- Apri il file "Analysis_batch.m" e cambia la directory della cartella come al passaggio 6.2. (Per gli utenti Windows, per il primo utilizzo, cambia "/" in "\" nelle righe 5, 6, 124 e 130)
- Fare clic sul pulsante Esegui per eseguire il codice "Analysis_batch.m" per determinare la chiralità di più modelli di anelli cellulari. Verrà generato un file "datatoexcel.txt", contenente statistiche circolari per ogni anello, nonché il numero di anelli in senso orario, non chirale e antiorario.
