Saggio di captazione delle vescicole extracellulari: un metodo per visualizzare e quantificare l'assorbimento cellulare delle vescicole extracellulari utilizzando la tecnica di imaging a fluorescenza 3D

Abstract

Fonte: Kim, C. J., et al., Saggio di captazione delle vescicole extracellulari tramite analisi di imaging al microscopio confocale. J. Vis. (2022).

In questo video, dimostriamo un test per visualizzare e quantificare l'assorbimento cellulare di vescicole extracellulari o EV. Questo test utilizza l'imaging fluorescente 3D utilizzando un microscopio confocale e consente di distinguere le vescicole extracellulari internalizzate da quelle aderenti alla superficie cellulare.

Protocol

1. Isolamento delle vescicole extracellulari ed etichettatura delle vescicole extracellulari immunofluorescenti su chip

1. Raccolta di terreni di coltura cellulare (CCM) e pre-elaborazione del CCM per l'isolamento delle vescicole extracellulari
   1. Seminare cellule PC3 alla confluenza del 30% in un pallone di coltura cellulare da 75 cm². Consentire alle cellule di controllo di crescere fino al 90% di confluenza (~48 ore) in terreni standard e integratori specifici per linee cellulari.
      nota: Per evitare che i componenti contenenti EV influenzino l'assorbimento cellulare (ad esempio, il siero bovino fetale), utilizzare terreni e integratori impoveriti di esosomi.
   2. Raccogli il CCM.
   3. Centrifugare il CCM a 1000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) per pellettare eventuali celle non attaccate e detriti di grandi dimensioni raccolti con il terreno. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico.
   4. Nella nuova provetta, centrifugare il surnatante a 10.000 x g per 20 minuti a 4 °C per pellettare i detriti più piccoli e i corpi apoptotici rimasti nel mezzo. Alcuni veicoli elettrici più grandi si riempiono di pellet. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
   5. Filtrare il surnatante attraverso un filtro a siringa a membrana idrofila in fluoruro di polivinilidene (PVDF) da 0,45 μm.
      nota: Se non si elabora immediatamente il CCM per l'isolamento EV, conservare il CCM pre-processato a -80 °C fino a quando non viene eseguito l'isolamento. Se congelato, limitare i cicli di gelo-disgelo a uno.
2. Isolamento di EV da CCM utilizzando un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione
   1. Se congelato, scongelare completamente il CCM e il vortice per 30 s prima del passaggio 1.2.2.
   2. Iniettare 1 mL di CCM pre-processato (passaggio 1.1) nella camera del campione del dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione (vedere la Tabella dei materiali).
      nota: Seguire la procedura operativa standard per il dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione.
   3. Centrifugare a 3000 giri/min per 10 minuti nel filatoio da banco (vedi Tabella dei materiali) per azionare il dispositivo microfluidico.
      nota: Se il CCM rimane sulla camera del campione dopo la corsa iniziale, eseguire ulteriori centrifughe fino a quando tutto il CCM non si è svuotato dalla camera del campione.
   4. Rimuovere il fluido dalla camera di scarico mediante pipettaggio e ripetere i passaggi 1.2.1, 1.2.2 e 1.2.3 due volte.
      nota: In totale, 3 mL di CCM saranno processati per l'isolamento delle vescicole extracellulari.
   5. Iniettare 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nella camera del campione per lavare le vescicole extracellulari isolate. Centrifugare il filatoio da banco per il funzionamento del dispositivo microfluidico come indicato al punto 1.2.3. Individua le EV pure sulla membrana del dispositivo.
      nota: La qualità delle vescicole extracellulari isolate dal dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione, in particolare, è stata confermata e confrontata con il metodo UC convenzionale mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM), microscopio elettronico a scansione (SEM), analisi di tracciamento di nanoparticelle (NTA), microscopia a illuminazione strutturata, saggio di immunoassorbimento enzimatico e PCR in tempo reale nella ricerca precedente.
3. Marcatura immunofluorescente di EV utilizzando un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione (Figura 1)
   1. Selezionare un anticorpo specifico per le vescicole extracellulari in base allo scopo del test (vedere la Tabella dei materiali).
      nota: Alcuni anticorpi possono interferire con i siti di legame del ligando specifici per le vie di assorbimento delle EV (ad esempio, endocitosi).
   2. Iniettare 1 μg/mL di anticorpo specifico per le vescicole extracellulari nel foro di eluizione del dispositivo contenente 100 μL di vescicole extracellulari isolate.
   3. Incubare per 1 ora al buio a RT su un agitatore a piastre per garantire la distribuzione uniforme dell'anticorpo sul campione.
   4. Attaccare un nastro adesivo al foro di eluizione. Iniettare 1 mL di PBS nella camera del campione per eliminare eventuali anticorpi residui.
   5. Far girare il dispositivo a 3000 giri/min fino a quando la camera del campione non è vuota. Rimuovere il liquido dalla camera di scarico mediante pipettaggio. Iniettare 1 mL di PBS nella camera del campione.
      nota: Le vescicole extracellulari marcate in fluorescenza saranno posizionate nella camera a membrana.
   6. Pipettare le vescicole extracellulari marcate in modo fluorescente (Figura 2) dalla camera a membrana in una provetta ambrata. Bloccare dalla luce fino all'uso.

2. Incubazione delle cellule con EV marcate in fluorescenza per il saggio di captazione delle EV

1. Semina e coltura cellulare target su piastre compatibili con colture cellulari.
   1. Seminare 1 x 10⁴ cellule PC3 nella piastra a 8 pozzetti per microvetrino (9,4 x 10,7 mm per ogni pozzetto) con 0,2 mL di terreno o 4 x 10⁴ cellule PC3 in una piastra da 35 mm con 1 mL di terreno. Piastra le cellule in un piatto compatibile con la coltura cellulare costituito da un vetrino coprioggetti sottile (spessore: 0,18 mm).
      nota: Il sottile vetrino coprioggetti riduce al minimo la dispersione negativa della luce.
   2. Lasciare aderire le cellule per una notte in condizioni ottimali di coltura cellulare (37 °C, 5% di concentrazione di CO₂, 90% di umidità).
   3. Lavare due volte le cellule aderenti con terreni impoveriti di esosoma (descritto al punto 1.1.1).
2. Incubazione cellulare con EV marcate in fluorescenza.
   1. Misurare la concentrazione di vescicole extracellulari marcate in fluorescenza (passaggio 1.3.5) mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA, Figura 3). Determinare la concentrazione ottimale di vescicole extracellulari marcate in fluorescenza da aggiungere alle cellule in coltura (passaggio 2.1.2.).
   2. Diluire le vescicole extracellulari marcate in fluorescenza con mezzi depleti di esosomi in modo che corrispondano alla concentrazione desiderata misurata al punto 2.2.1. (ad esempio, 7,80 x 10⁹ EV (in valore NTA) in 200 μL di terreno impoverito di esosomi.)
   3. Aggiungere le vescicole extracellulari diluite (passaggio 2.2.2) alle cellule bersaglio aderenti preparate al punto 2.1.2. Incubare per il tempo sperimentale (cioè 4, 8 o 12 ore).
   4. Lavare le cellule tre volte con terreni privi di esosomi per rimuovere eventuali vescicole extracellulari non internalizzate.
      nota: Opzionale: le celle possono essere fissate dopo il lavaggio.
   5. Etichettare il citoplasma delle cellule aderenti con 1 μg/mL di CMTMR ((5-(e-6)-(((4-clorometil)benzoil)ammino) tetrametilrodamina) (vedi Tabella dei materiali) e incubare in condizioni ottimali di coltura cellulare (37 °C, 5% di concentrazione di CO₂, 90% di umidità).
      nota: I coloranti dell'area cellulare dovrebbero essere fluorescenti separatamente dalle vescicole extracellulari marcate per aiutare a determinare la posizione spaziale (internalizzata o superficiale) delle vescicole extracellulari addizionate durante il saggio di captazione delle vescicole extracellulari.
   6. Lavare due volte le cellule marcate con terreni espletati per rimuovere il colorante residuo. Aggiungere alle cellule terreni freschi impoveriti di esosomi in preparazione per l'imaging confocale su cellule vive.

3. Microscopia confocale

1. Per eseguire l'imaging di cellule vive, utilizzare un incubatore sul palco per mantenere le condizioni ottimali di coltura cellulare (37 °C, 5% di concentrazione di CO₂, 90% di umidità).
2. Posizionare le cellule preparate nell'incubatore sul palco.
3. Impostare i parametri di imaging in base ai campioni di controllo.
   nota: I campioni di controllo suggeriti includono: solo vescicole extracellulari marcate in fluorescenza, cellule marcate in fluorescenza, vescicole extracellulari non marcate e cellule non marcate.
4. Determinare la profondità delle celle target e l'intervallo di dimensioni di impilamento nella direzione z per acquisire immagini confocali 3D.
   nota: Lo spessore di uno Z-stack è di 1 μm. L'acquisizione dell'immagine 3D confocale è durata 2 minuti e 34 secondi (ogni acquisizione di immagini del piano Z ha richiesto circa 8 secondi; per un totale di venti immagini Z-stack).
5. Impostare l'acquisizione dell'immagine su più immagini z-stacked di colorante specifico per cellula (ad esempio, rosso) e colorante specifico per EV (ad esempio, verde) contemporaneamente (Figura 4 e Figura 5A).

4. Elaborazione delle immagini

1. Utilizzare un software di elaborazione automatica delle immagini per analizzare le immagini confocali grezze z-stacked e determinare l'assorbimento delle vescicole extracellulari da parte delle cellule (vedi Tabella dei materiali).
2. Impostare i parametri di soglia in base al segnale fluorescente delle celle e ai coloranti specifici per le vescicole extracellulari. Costruisci le superfici virtuali delle celle (Figura 5A, B).
   1. Per costruire le superfici virtuali delle celle, fare clic sul pulsante Aggiungi nuove superfici.
   2. Selezionare Calcolo della distanza più breve come "Impostazioni algoritmo" per utilizzare l'algoritmo fornito dal software, quindi fare clic su Avanti: Canale sorgente.
   3. Selezionare Canale 2 - CMTMR come "Canale di origine" in questo esperimento.
   4. Selezionare Leviga e inserire il valore appropriato in "Dettaglio superfici" per la levigatura delle superfici.
      NOTA: 0,57 μm in questo esperimento poiché 1 pixel rappresenta 0,57 μm nei dati di imaging grezzi.
   5. Seleziona Intensità assoluta come "Soglia".
   6. Per soccaricare automaticamente l'immagine fluorescente in base all'algoritmo fornito, fare clic su Soglia (intensità assoluta): il valore viene impostato automaticamente.
   7. Selezionare Abilita come "Dividi oggetti toccanti (crescita della regione)" e inserire il valore della dimensione stimata della cella in "Diametro dei punti di semina", 10,0 μm in questo esperimento. Quindi fare clic su Avanti: Filtra punti seme.
   8. Per configurare le superfici delle celle virtuali, fare clic sul pulsante + Aggiungi, quindi selezionare Qualità come "Tipo di filtro". Soglia il valore appropriato (210 in questo esperimento) per il limite inferiore mediante un'ispezione visiva e il valore massimo (1485) per il limite superiore, quindi fare clic sul pulsante Fine.
      nota: Un'ispezione visiva significa che un ricercatore può discriminare l'area cellulare da un'immagine fluorescente grezza.
   9. Successivamente, per costruire i punti virtuali dei veicoli elettrici, fai clic sul pulsante Aggiungi nuovi punti.
   10. Seleziona Diverse dimensioni dello spot (regione crescente) e Calcolo della distanza più breve come "Impostazioni algoritmo", quindi fai clic su Avanti: Canale sorgente.
   11. Seleziona il canale 1 - Alexa Fluor 488 come "Canale sorgente" in questo esperimento.
   12. Inserire il valore appropriato in "Diametro XY stimato" per il rilevamento spot, 1 μm in questo esperimento. Quindi, fai clic su Avanti: Filtra punti.
   13. Per configurare i punti EV virtuali, fare clic sul pulsante + Aggiungi, selezionare Qualità come "Tipo di filtro" e impostare "Soglia inferiore" mediante un'ispezione visiva, 100 in questo esperimento. Quindi, fare clic sul pulsante Avanti: Tipo di regione spot.
   14. Seleziona Intensità assoluta come "Tipo di regioni spot", quindi fai clic su Avanti: Regioni spot.
   15. Per sogliare, la regione dei punti EV, inserire il valore appropriato in "Soglia della regione" mediante un'ispezione visiva, 100 come "Soglia della regione" in questo esperimento.
       nota: Un'ispezione visiva significa che un ricercatore può discriminare l'area delle vescicole extracellulari da un'immagine fluorescente grezza.
   16. Selezionare Volume regione come "Diametro da", quindi fare clic su Fine.
3. Utilizzare gli algoritmi forniti dal software per dividere i punti raggruppati all'interno della superficie costruita al passaggio 4.2 (Figura 5C, i-iv).
   1. Fai clic sugli spot creati, quindi vai su Filtri.
   2. Fare clic sul pulsante + Aggiungi, quindi selezionare Distanza minima dalle superfici Superfici = Superficie 1 come Tipo di filtro, quindi fare clic sul pulsante Duplica selezione in nuovi punti. La soglia più bassa (-7,0 in questo esperimento) per il limite inferiore e il valore appropriato (-0,5) per il limite superiore.
      nota: Impostare il limite superiore con il raggio stimato di Spot. In questo esperimento, il diametro stimato delle macchie, cioè i punti EV, è stato impostato a 1 μm nel passaggio 4.2.11.; Pertanto, il limite superiore può essere 0,5.
4. Conteggio automatico delle vescicole extracellulari all'interno delle celle
   nota: Il software conterà automaticamente il numero di EV all'interno delle celle, indicando il numero interiorizzato dalle cellule bersaglio.
   1. Fare clic sulla selezione Spot 1 costruita [Distanza minima dalle superfici Superfici = Superfici 1 tra -7.00 e -0.500].
   2. Vai alle Statistiche ed esporta il valore da "Numero totale di spot"
      nota: Gli algoritmi forniti dal software calcoleranno automaticamente il numero e il volume delle celle.
5. Determinare la resa di assorbimento delle EV per periodo di incubazione in base ai valori sopra calcolati (Figura 6).
   1. Per ottenere il numero di celle, fare clic su Superfici costruite 1, quindi andare su Statistiche ed esportare il valore di "Numero totale di superfici" da Generale.
   2. Vai su Dettagliato in Statistiche per esportare il volume da Dettagliato.

Results

Figura 1: Illustrazione schematica dell'isolamento delle vescicole extracellulari e della marcatura su chip utilizzando un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione. (A) Isolamento delle vescicole extracellulari dal CCM. (B) Marcatura immunofluorescente su chip di vescicole extracellulari. (C) Rimozione degli anticorpi non ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anticorpo CD63 umano	Bioleggenda	353038	Anticorpo EV-specifico coniugato con colorante fluorescente
CellTracker Colorante CMTMR arancione	Thermo Fisher Scientifico	Codice: C2927	Reagente di marcatura fluorescente su cellule vive (citoplasma)
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Obiettivo per imaging confocale, NA=1,25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Obiettivo per imaging confocale, NA=0,75
Esodisco	Labspinner Inc.	EX-D1001	Un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione per l'isolamento di veicoli elettrici
ExoDiscovery	Labspinner Inc.	EX-R1001	Dispositivo di comando per Exodisc
FBS impoverito di esosomi	Thermo Fisher Scientifico	A2720801	Nutriente dei terreni di coltura cellulare per la raccolta di EV derivate da linee cellulari PC3
Siero fetale bovino (FBS)	VWR	1500-500	Nutriente per la coltivazione cellulare
Capra Anti-Topo IgG H&L preadsorbito	abcam	ab7063	Anticorpo IgG di topo per il controllo negativo della marcatura delle vescicole extracellulari
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	Codice 81156	Piatto di coltura per imaging confocale
Imaris 9.7.1	Strumenti Oxford	9.7.1	Software di post-elaborazione delle immagini
Sistema di incubazione + miscelatore di gas CO2/O2/N2	Strumento per cellule vive	TU-O-20	Sistema di incubazione per l'imaging di cellule vive
Fotocamera Nikon A1 HD25 / A1R HD25	Nikon	Na	Fotocamera per imaging confocale
Microscopio Nikon Eclipse Ti	Nikon	Na	Microscopio invertito per imaging confocale
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Software di elaborazione delle immagini per microscopio Nikon
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	Dispositivo di misurazione della concentrazione di vescicole extracellulari
OriginPro 2020	Laboratorio Originato	9.7.0.185	Software per la grafica
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientifico	15140122	Antibiotici per la coltura cellulare
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientifico	21875034	Terreni di coltura cellulare per la coltura di linee cellulari PC3
SYTO RNASelect Colorazione cellulare fluorescente verde - 5 mM Soluzione in DMSO	Thermo Fisher Scientifico	S32703	Colorante fluorescente per colorazione dell'RNA per la marcatura delle vescicole extracellulari