Il saggio di cattura delle particelle simili al virus: un metodo per isolare le VLP che visualizzano l'antigene da un campione utilizzando biglie magnetiche coniugate con anticorpi neutralizzanti

Abstract

Fonte: Rosengarten, J. F., et al. Rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione negli antigeni visualizzati su vaccini basati su particelle simili a virus (VLP) utilizzando un test di cattura. J. Vis. Exp. (2022).

In questo video, dimostriamo un test di immunoprecipitazione, chiamato test di cattura VLP, per isolare particelle simili a virus che visualizzano l'antigene, o VLP, da un campione. L'antigene si lega con anticorpi specifici legati a biglie magnetiche, formando un complesso antigene-anticorpo immobilizzato che viene successivamente separato e conservato per ulteriori analisi.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Seminare le linee cellulari in sospensione produttrici di VLP derivate da cellule 293-F che esprimono geni strutturali dell'HIV gag da sole o in concerto con env a una bassa densità cellulare di 0,5 x 10⁶ cellule per mL in terreno di espressione 293-F.
2. Lasciarli espandere per 3-4 giorni a 37 °C e 8% di CO₂ in una rotazione dell'incubatore shaker con un'orbita di 5 cm e 135 giri al minuto (rpm).
3. Pellettare le cellule produttrici mediante centrifugazione a 100 x g per 5 minuti. Filtrare il surnatante chiarificato per rimuovere le cellule residue e i detriti cellulari utilizzando filtri per siringa a membrana in fluoruro di polivinilidene (PVDF) da 0,45 μm per ottenere un surnatante per colture cellulari (CFSN).
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. La CFSN può essere conservata durante la notte a 4 °C.
4. Utilizzare la CFSN direttamente per l'esperimento o pellettare VLP da 35 mL di CFSN utilizzando l'ultracentrifugazione (112.700 x g, 4 °C, 1,5 h).
5. Dopo l'ultracentrifugazione, scartare il surnatante e sospendere i pellet VLP in 200 μL di soluzione di trealosio al 15% (p/v) per provetta da centrifuga.
   NOTA: Il pellet VLP spesso non è visibile ad occhio nudo. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Le VLP possono essere conservate a -80 °C.
6. Prima del test di cattura VLP, determinare le concentrazioni virali delle proteine principali nei campioni contenenti VLP utilizzando un ELISA. Questo passaggio è importante per standardizzare l'input del saggio di cattura.

2. Saggio di cattura VLP

NOTA: Una panoramica del flusso di lavoro è illustrata nella Figura 1.

1. Sospendere le microsfere magnetiche pipettandole verso l'alto e verso il basso o mescolandole su un rotatore a 50 giri/min per almeno 5 minuti.
2. Nel frattempo, preparare la soluzione anticorpale contenente il bNAbs. Utilizzare 10 μg di ciascun bNAb in 200 μL di tampone di legame e lavaggio degli anticorpi (vedere la Tabella dei materiali) per reazione.
   NOTA: Le quantità di anticorpi possono variare a seconda dell'affinità del bNAb e della densità di decorazione dell'antigene sulle VLP utilizzate.
3. Utilizzare 50 μl della soluzione di microsfere magnetiche (vedere la tabella dei materiali) per reazione e trasferire le microsfere in una provetta di reazione da 1,5 mL. Posizionare le provette sul rack di separazione magnetica.
   NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un potente magnete singolo per ogni tubo per separare le perle dal surnatante.
4. Attendere qualche minuto fino a quando le perline si raccolgono sulla parete del tubo per assicurarsi che tutte le perline siano raccolte. Rimuovere il surnatante.
5. Rimuovere il magnete e sospendere le perle in 200 μL della soluzione di bNAb preparata al punto 2.2. Incubare per 30 minuti - 3 ore mescolando su un rotatore a 50 giri/min a temperatura ambiente.
6. Posizionare nuovamente le provette di reazione nel rack di separazione magnetica, attendere e rimuovere il surnatante.
7. Rimuovere i tubi dal magnete e lavare le perle risospendendo in 200 μL di tampone di legame e lavaggio degli anticorpi.
8. Ripetere il passaggio 2.4. Rimuovere quanto più tampone di lavaggio possibile.
9. Aggiungere i campioni al bNAbs.
   NOTA: L'input VLP per il saggio di cattura utilizzando particelle derivate dall'HIV deve essere di almeno 15 ng di proteina del nucleo virale per reazione. Le quantità di VLP possono variare a seconda dell'affinità del bNAb e della densità di decorazione dell'antigene sulle VLP utilizzate.
10. Se il volume del campione aggiunto al punto 2.9 è inferiore a 1 ml, aggiungere PBS per regolare il volume del campione a 1 ml. Sospendere delicatamente le perle pipettandole.
11. Incubare i campioni e le perle per 2,5 ore su un rotatore a temperatura ambiente. Assicurarsi che le perle rimangano in sospensione e che la soluzione sia accuratamente miscelata durante l'incubazione.
12. Posizionare i tubi sul magnete e rimuovere il surnatante.
13. Lavare le microsfere magnetiche sospendendole in 200 μL di tampone di lavaggio (vedi Tabella dei materiali). Ripetere la fase di lavaggio tre volte.
14. Sospendere le perle in 100 μl di tampone di lavaggio e trasferire la sospensione in una provetta di reazione pulita (resistente al calore).
15. Posizionare la provetta sul rack di separazione magnetica (vedere la Tabella dei materiali) e rimuovere completamente il surnatante.
16. Preparare campioni SDS-PAGE denaturati seguendo i passaggi 2.16.1-2.16.2 o campioni non denaturati eluendo le VLP dalle microsfere magnetiche seguendo i passaggi 2.16.3-2.16.5.
    1. Per preparare campioni SDS-PAGE denaturati, sospendere le perle in 20-80 μL di tampone Laemmli (0,8 μL di tampone Laemmli per 1 ng di p55 Gag in ingresso) e incubare a 95 °C per 5 min.
    2. Procedere direttamente con SDS-PAGE o conservare i campioni a -20 °C.
       ATTENZIONE: Il tampone Laemmli contiene 2-mercaptoetanolo e sodio dodecil solfato. Indossare guanti protettivi e protezione per gli occhi. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e i vestiti. Non inalare i vapori. Lavorare in uno spazio ben ventilato, ad esempio una cappa aspirante.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
    3. In alternativa, eseguire una fase di eluizione non denaturante per ottenere VLP con struttura proteica nativa preservata.
    4. Aggiungere 25 μl di tampone di eluizione (spesso fornito con le microsfere) alle microsfere magnetiche e incubare per 2-5 minuti a temperatura ambiente.
    5. Rimuovere le perline e trasferire l'eluato in un tubo pulito. Utilizzare l'eluato per i saggi successivi o conservarlo a 4 °C.
       NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

Risultati

Figura 1: Illustrazione schematica delle fasi chiave del saggio di cattura VLP utilizzando surnatanti privi di cellule. (1) Il test di cattura VLP inizia con il legame dei bNAbs dell'HIV-1 alle microsfere magnetiche accoppiate alla proteina G. Nel frattempo, viene preparata la soluzione VLP con una concentrazione definita di p55. Il surnatante di coltura cellulo-free è costituito da ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette di reazione da 1,5 mL	Eppendorf
10x PBS	Gibco	70011044
Anticorpi (bnAbs)	Polymun Scientic
Dynabeads Proteina G Kit per immunoprecipitazione	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	10007D	Include tamponi e lavaggio soluzioni
Celle FreeStyle 293-F	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	R790-07
FreeStyle 293 Espressione Medium	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	12338026
Rack di separazione magnetico	Biolaboratori del New England	S1509S	per 12 provette da 1,5 mL o 6 provette da 1,5 mL
Ultracentrifuga Optima XE-90	Beckman Coulter
Fluoruro di polivinilidene (PVDF) Filtri per siringhe, 0,45 μm	Carl Roth	KC89.1
PVDF di trasferimentoa membrana, 0,45 μm	Carl Roth	T830.1
Titolo rapido HIV p24 ELISA	Biolaboratori cellulari	VPK-108-H
rotatore	Heidolph	REAX2
Rotore SW28	Beckman Coulter
Termomiscelatore	Cel Media	basico
Trealosio diidrato	Carl Roth	8897.2
Provette da centrifuga ultra trasparenti	Beckman Coulter	344058