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1. Nuovo design della camera (Figura 1)
- Aprire una nuova piastra dell'analizzatore di celle a doppia camera. Mettere da parte la camera superiore con gli elettrodi.
- Utilizzando una fresatrice, radere 2 mm dei pozzetti inferiori a forma di U della piastra dell'analizzatore di celle.
- Attacca una membrana in polietersulfone (PES) di 2 cm x 7 cm con pori di 0,2 μm sul fondo dei pozzetti rasati utilizzando un adesivo curato con UV. Attendere 30 minuti di cura per assicurarsi che la colla sia completamente indurita e inerte.
- Utilizzando una fresatrice, ritagliare due fessure longitudinali (1,5 mm x 5,6 mm) lungo i lati per inserirle nelle creste della terza camera appena fabbricata.
- Utilizzando una fresatrice, creare una terza camera in policarbonato che riproduca le dimensioni complessive della piastra dell'analizzatore di celle; 72 mm x 18 mm (Tabella dei materiali).
- Crea pozzetti di 4,8 mm di profondità e 4,75 mm di diametro per replicare il design a 16 pozzetti della piastra dell'analizzatore di celle. Ciò consente 90 μL di volume per pozzetto.
- Ai lati, creare due creste triangolari in modo che la camera si blocchi nelle fessure originali create nel passaggio 1.4. La parte orizzontale del triangolo è di 1,5 mm, quella verticale è di 1,4 mm e l'ipotenusa è di 2,052 mm.
- Creare una manopola sul lato corto di 50,8 mm di diametro e 1,397 mm di altezza da inserire nella tacca della piastra originale (Figura 1, al centro).
- Utilizzare una rondella di gomma spessa 0,9 mm per ogni pozzetto per garantire una tenuta ermetica.
2. Coltura cellulare (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblasti)
- Lavare le colture cellulari aderenti (~70% di confluenza) con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aggiungere una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% per sollevare le cellule.
- Neutralizzare la soluzione di tripsina con terreni di coltura cellulare contenenti siero e contare le cellule utilizzando un'aliquota della sospensione cellulare.
nota: I terreni di coltura cellulare specifici sono riportati nella Tabella 1.
3. Dissociazione da xenotrapianto derivata dal paziente
- Tritare un pezzo di tumore fresco (1 cm2) in poltiglia fine usando un bisturi sterile.
- Mettere in una provetta conica da 50 mL con 20 mL di terreno DMEM F12 integrato con 3 mg/mL di tripsina e 2 mg/mL di collagenasi.
- Incubare in un agitatore termico (150 RPM) a 37°C per 20 min.
- Centrifugare il tubo a 500 x g per 5 minuti; rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 20 μL di DMEM F12 + 2% FBS per lavare le cellule; centrifugare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio altre due volte.
- Risospendere in 1 mL di terreno PDX (Tabella 1) per contare le cellule.
4. Estrazione di cellule di midollo osseo
- Lavare il filtro di raccolta del midollo osseo (BM) con 25 mL di 1x PBS.
nota: In questo studio, il PBS è stato aggiunto a un filtro di raccolta del midollo osseo utilizzato dall'ospedale per raccogliere il midollo osseo rimanente nel filtro.
- Aggiungere lentamente il BM lavato in una provetta conica da 50 mL con 25 mL di terreno a gradiente di densità, facendo attenzione a mantenere gli strati il più separati possibile.
- Centrifugare a 800 x g per 20 min a 18 °C.
- Aspirare gli strati superiori dopo la centrifugazione (grasso/plasma) e trasferire 5 mL dello strato bianco sopra il mezzo di gradiente di densità che contiene le cellule BM in una provetta conica da 15 mL.
nota: In alternativa, immergere una pipetta da 5 ml nello strato superiore fino a toccare lo strato intermedio (BM) e pipettare lo strato intermedio molto lentamente senza muovere la pipetta.
- Riempire la provetta conica da 15 mL con 1x PBS (~10 mL) e centrifugare a 300 x g per 15 min.
- Rimuovere il surnatante; il pellet bianco rimanente è il BM.
- Se si osservano globuli rossi nel pellet, aggiungere 5 mL di soluzione di lisi dei globuli rossi (Tabella dei materiali) e lasciarla riposare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Centrifugare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 10 ml di 1x PBS per lavare le cellule, centrifugare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Ripetere la lisi dei globuli rossi (passaggio 4.7) fino a quando il pellet non diventa bianco.
5. Semina e assemblaggio delle celle
- Posizionare tutte e tre le camere sterili nella cappa di coltura tissutale.
- Individuare la manopola sul lato corto della camera inferiore. Orientare la camera inferiore in modo che la manopola sia rivolta verso lo sperimentatore.
- Aggiungere 30.000-50.000 cellule in 90 μl di terreno in ciascun pozzetto della camera inferiore. Evitare la formazione di bolle. Queste sono le cellule stromali che forniranno fattori secreti ma non saranno rilevate dagli elettrodi della camera superiore.
- Utilizzare il 5% di terreno integrato con siero fetale bovino in due pozzetti della camera inferiore come controllo positivo per la motilità cellulare. Utilizzare terreni integrati con siero allo 0% come controllo negativo.
- Lasciare riposare la camera inferiore con le celle per 10-15 minuti nel cofano per stabilizzarsi.
nota: Questo passaggio è consigliato se le cellule sono aderenti o crescono in sospensione.
- Ruotare la camera inferiore di 90° e posizionare la camera centrale in alto in modo che la manopola sulla camera inferiore scivoli nella tacca sulla camera centrale.
nota: La manopola sulla camera inferiore e il punto blu sulla camera centrale si trovano alle estremità opposte del gruppo.
- Spingere verticalmente verso il basso finché non si sente un clic da ciascuno dei lati lunghi del gruppo.
- Aggiungere 160 μL di terreno privo di siero a tutti i pozzetti della camera centrale.
- Assicurarsi che un menisco a forma di cupola sia visibile dopo che i pozzetti sono stati riempiti; in caso contrario, regolare il volume finale in base alla calibrazione della pipetta. Evitare la formazione di bolle.
- Posizionare la camera superiore con gli elettrodi rivolti verso il basso sulla camera centrale assicurandosi di allineare i punti blu sulla camera centrale e superiore.
- Spingere verticalmente verso il basso finché non si sente un clic da ciascuno dei lati lunghi del gruppo.
- Aggiungere 25-50 μl di terreno privo di siero nella camera superiore.
- Montare il gruppo sull'analizzatore cellulare a doppia funzione nell'incubatore per colture tissutali e attendere 30 minuti prima di misurare il background.
nota: Questo tempo è necessario per equilibrare l'array e può essere utilizzato per preparare le linee cellulari da aggiungere alla camera superiore.
- Misurare il fondo (vedere la sezione 6) e riposizionare l'assemblaggio nella cappa di coltura tissutale.
- Aggiungere 30.000-50.000 cellule in 100 μL di terreno privo di siero in ciascun pozzetto della camera superiore. Queste sono le cellule che l'elettrodo rileverà una volta che migreranno con successo attraverso la membrana
nota: Per ottenere la massima risposta, si consiglia di far crescere le cellule in terreni privi di siero o a basso contenuto di siero per 6-18 ore prima di eseguire il test.
- Lasciare riposare il gruppo nella cappa per 30 minuti prima di montarlo sull'analizzatore di celle a doppia funzione per la misurazione dell'impedenza.
6. Misurazione del fondo e dell'impedenza
- Posizionare l'array nella culla dello strumento analizzatore di cellule a doppio scopo.
- Aprire il software dell'analizzatore di celle e selezionare la base da utilizzare.
- Fare clic sulla scheda Messaggio e assicurarsi che sia indicato Connessioni OK per assicurarsi che l'array sia ben posizionato nella base e che gli elettrodi siano ben allineati con i sensori.
- Fai clic sulla scheda Note dell'esperimento e inserisci quante più informazioni possibili sull'esperimento.
- Fare clic sulla scheda Layout e inserire la descrizione del layout dell'array.
- Fare clic sulla scheda Pianificazione e aggiungere due passaggi dal menu Passaggi: un passaggio in background (uno sweep) e un passaggio di test con 100 sweep, uno sweep ogni 15 minuti, per un totale di 25 ore.
- Dopo che l'array è rimasto nell'incubatore dell'analizzatore di celle a doppia funzione per 30 minuti, fare clic sul pulsante Riproduci per avviare la misurazione in background. Verrà visualizzata una finestra che chiede di scegliere la cartella in cui salvare i dati.
- Al termine della misurazione di fondo, rimuovere l'array dalla base e riposizionarlo nella cappa di coltura cellulare.
- Aggiungere le cellule alla camera superiore come descritto al punto 5.13 e mantenere il gruppo nella cappa di coltura tissutale per 30 minuti affinché le cellule si depositino.
- Riposizionare l'array nell'analizzatore di celle a doppio uso e controllare la scheda Messaggio per il messaggio Connessioni OK.
- Fare clic sul pulsante Riproduci per avviare la misurazione dell'impedenza.
- Fare clic sulla scheda Grafico per monitorare l'andamento del segnale.
- Se l'endpoint viene raggiunto prima di 25 ore, fare clic sul passaggio Interrompi dal menu a discesa Esegui.
- Per esportare i dati, fai clic con il pulsante destro del mouse sul grafico, scegli Copia nel formato elenco e quindi incolla i dati in un foglio di calcolo.
nota: I dati possono essere esportati come indice di cella o indice di cella delta. È inoltre possibile scegliere le informazioni sul grafico e/o sul layout per l'esportazione.
Tabella 1: Composizione dei terreni di coltura cellulare. La tabella elenca le composizioni dei terreni MDA-MD-231, dei terreni J2 Fibroblasts, dei terreni DCIS e dei terreni PDX.
| media | Costituenti | Concentrazione/proporzione |
| Supporti MDA-MD-231 | DMEM | |
| Siero fetale bovino (FBS) | 10% |
| J2 Fibroblasti media | DMEM | |
| Siero fetale bovino (FBS) | 10% |
| Supporti DCIS | DMEM F12 | |
| Siero per cavalli (HS) | 5% |
| Fattore di crescita epidermico (EGF) | 20 ng/mL |
| insulina | 10 μg/mL |
| idrocortisone | 0,5 μg/mL |
| Tossina del colera | 100 ng/mL |
| Supporti PDX | DMEM F12 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | 2% |
| HEPES | 1 M |
| Insulina Transferrina Selenio Etanolammina (ITS) | 10 μg/mL |
| idrocortisone | 0,5 μg/mL |
| Albumina sierica bovina (BSA) | 1 mg/mL |
