Saggio dell'attività della citrato sintasi: un test colorimetrico per misurare l'attività della citrato sintasi mitocondriale nell'omogenato tissutale di Drosophila

Abstract

Fonte: Wei, P., et al., Un saggio colorimetrico dell'attività della citrato sintasi in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video descrive un test colorimetrico per misurare il test di attività della citrato sintasi mitocondriale presente nell'omogeneizzato tissutale di Drosophila.

Protocollo

1. Saggio colorimetrico dell'attività della citrato sintasi per D. melanogaster

1. Raccogli dieci mosche adulte per ogni campione. Raccogliere almeno campioni triplicati per ogni genotipo.
2. Preparare 500 μL di tampone di estrazione a freddo contenente 20 mM di HEPES (pH = 7,2), 1 mM di EDTA e 0,1% di tritone X-100 in una provetta da 1,5 mL per ogni campione.
3. Anestetizzare i moscerini adulti con CO₂ su un tampone per anestesia e isolare i tessuti desiderati. Per isolare il torace della mosca adulta, ad esempio, fissare il torace della mosca con un paio di pinze, quindi isolare l'adduscolo della mosca tagliando lungo il bordo del torace e dell'addome usando un paio di forbici. Raccogliere il torace di mosca per il test di attività della citrato sintasi muscolare.
   nota: Determinare il peso fresco del tessuto in questa fase se lo si utilizza per normalizzare l'attività della citrato sintasi.
4. Trasferire immediatamente 10 toraci di mosca adulta in 100 μL di tampone di estrazione ghiacciato e omogeneizzare con un pestello sul ghiaccio. Per mantenere i campioni ghiacciati, omogeneizzare i campioni per 5-10 s sul ghiaccio, quindi far riposare i campioni sul ghiaccio per 5 s e ripetere fino a quando tutti i tessuti della provetta non sono completamente omogeneizzati><. nota: Fissare la provetta con nastro adesivo, controllare gli omogeneizzati per assicurarsi che non vi siano coaguli negli omogeneizzati e che i tessuti nella provetta siano completamente omogeneizzati. Tutti i trattamenti dei campioni devono essere eseguiti su ghiaccio.
5. Prelevare 10 μl di ciascun campione omogeneizzato in una nuova provetta per la misurazione del contenuto proteico. Conservare i campioni per la misurazione delle proteine su ice.
   nota: I campioni di proteine possono essere congelati e conservati a -80 °C per analisi successive. Le concentrazioni proteiche fungono da parametro interno per la normalizzazione delle attività della citrato sintasi.
6. Aggiungere 400 μl di tampone di estrazione a freddo ghiacciato a ciascun campione rimanente per ottenere un volume totale di 500 μl. Mescolare bene pipettando delicatamente su e giù almeno 5 volte, evitando la formazione di bolle. Per ogni reazione, aggiungere 1 μL di lisato cellulare diluito a 150 μL della soluzione di reazione appena preparata (20 mM di Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM di DTNB, 0,3 mM di acetil CoA, 1 mM di acido ossalacacetico). Miscelare accuratamente e immediatamente pipettando delicatamente, evitando la formazione di bolle. Misurare l'assorbanza a 412 nm ogni 10-30 s per 4 min a 25 °C utilizzando un lettore di piastre in grado di misurare l'assorbanza a 412 nm ad intervalli minimi di 10 s.
   nota: Sostituire il puntale prima di pipettare un reagente diverso ed evitare la formazione di bolle nei pozzetti. Una miscelazione incompleta dei reagenti può causare variazioni nelle misurazioni. Il test dell'attività della citrato sintasi deve essere eseguito a temperatura ambiente subito dopo la raccolta dei campioni, poiché questo test viene utilizzato per quantificare la massa mitocondriale intatta. Il tampone di reazione deve essere preparato immediatamente prima dell'uso e non deve essere conservato.
7. Traccia i dati come densità ottica (OD), assorbanza (abs) (asse Y) rispetto al tempo (in minuti) (asse X). Quindi calcola la pendenza per la parte lineare della curva, dove la velocità di reazione è
   
   Dividi il valore per la concentrazione proteica del campione per normalizzare l'attività della citrato sintasi. L'attività della citrato sintasi è calcolata come
   
   nota: La concentrazione proteica del campione può essere misurata con un kit di analisi della concentrazione proteica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido 2-[4-(2-idrossietil)-1-piperazinil]etansolfonico (HEPES)	Sigma-Aldrich	V900477
2-ammino-2-(idrossimetil)-1,3-propandiolo (base TRIZMA)	Sigma-Aldrich	V900483
Acetil CoA	Sigma-Aldrich	Codice: A2181
Acido ditio-bis-nitrobenzoico (DTNB)	Sigma-Aldrich	D8130
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	V900106
ossalacetato	Sigma-Aldrich	O4126
Pestello a pellet	Sangon	F619072
Motore a pestello a pellet	Tiangen	OSE-Y10
Lettore di lastre	BioTek	eone
Kit per il dosaggio delle proteine BCA	Beyotime	P0010S
forbici	WPI	Codice: 14124
Triton X-100	Sangon	A110694-0100