Saggio di protezione enzimatica a base di lisostafina: un metodo in vitro per quantificare il carico intracellulare di Staphylococcus aureus mediante uccisione selettiva mediata da enzimi di batteri extracellulari

Abstract

Fonte: Rigaill, J. et al. Saggio di protezione enzimatica migliorato per studiare l'internalizzazione dello Staphylococcus aureus e l'efficacia intracellulare dei composti antimicrobici. J. Vis. Exp. (2021).

In questo video, dimostriamo un test di protezione enzimatica in vitro basato sulla lisostafina per quantificare l'internalizzazione di Staphylococcus aureus nelle cellule A549. Il test aiuta negli studi qualitativi, quantitativi e di caratterizzazione della carica batterica intracellulare nelle cellule ospiti.

Protocollo

1. Inoculazione cellulare

1. Iniziare con una coltura di cellule epiteliali umane A549 in Eagle medium modificato (DMEM) di Dulbecco ad alto glucosio con rosso fenolo, integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) senza antibiotici.
2. Osservare ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti mediante microscopia a basso ingrandimento per assicurarsi che le cellule epiteliali umane siano sane e crescano come previsto.
3. Rimuovere ed eliminare il terreno di coltura cellulare esaurito dalla piastra a 24 pozzetti.
4. Aggiungere 500 μl della sospensione batterica di Staphylococcus aureus preparata in DMEM senza rosso fenolo, per l'inoculazione in ciascun pozzetto con cellule confluenti al 100%.
5. Incubare le cellule per 2 ore a 36 ± 1 °C e 5% di CO₂,
   NOTA: si consiglia di utilizzare tre pozzetti della piastra per ogni condizione da testare (triplicato) e di eseguire almeno tre esperimenti indipendenti. Il ritardo di incubazione può essere adattato in base all'obiettivo sperimentale.

2. Quantificazione di batteri intracellulari con saggio di protezione enzimatica migliorata (iEPA)

1. Preparare 7 mL di tampone di lisi 4x con 3,5 mL di Triton X-100 al 2% in acqua sterile e 3,5 mL di tripsina-EDTA.
2. Preparare una soluzione madre di lisostafina a 10 mg/mL in tampone acetato e aliquotare 25 μL in crioviali. Conservare a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
3. Preparare 250 μl di una soluzione di lavoro di lisostafina fresca a 1 mg/mL mescolando 25 μl della soluzione madre di lisostafina (10 mg/mL) e 225 μl di Tris-HCl 0,1 M. Conservare a 4 °C per un massimo di 48 ore.
4. Preparare 6,25 mL di terreno di infezione completo integrato con lisostafina aggiungendo 6 mL di terreno di infezione completo a 250 μL della soluzione di lavoro di lisostafina.
5. Aggiungere 250 μl di terreno di infezione completo integrato con lisostafina in ciascun pozzetto e agitare delicatamente la piastra ruotandola a mano.
6. Incubare le cellule per 1 ora a 36 ± 1 °C in CO₂ al 5% per consentire alla lisostafrina di uccidere i batteri extracellulari.
7. Al termine del tempo di incubazione, aggiungere 10 μL di proteinasi K a 20 mg/mL in ciascun pozzetto per inattivare la lisostafina.
8. Incubare le cellule per 2 minuti a temperatura ambiente.
9. Aggiungere 250 μl di tampone di lisi 4x per lisare le cellule mediante shock osmotico.
10. Incubare le cellule per 10 minuti a 36 ± 1 °C.
11. Miscelare accuratamente pipettando su e giù dieci volte su tutto il fondo del pozzetto per assicurarsi che le cellule siano completamente lisate e omogeneizzate.
12. Utilizzare un piatto a spirale automatico per determinare il carico di S. aureus di ciascun pozzetto.
13. Incubare le piastre di agar per 18-24 ore a 36 ± 1 °C.
14. Il giorno successivo, contare il numero di colonie con un contatore di colonie per calcolare il carico intracellulare di S. aureus di ciascun pozzetto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra a 24 pozzetti	CORNING-FALCON	353047
Linea cellulare A549	ATCC	CCL-185
Soluzione tampone acetato pH 4,6	Fluka	Telefono 31048	Utilizzato per preparare la soluzione madre di lisostpahina a 10 mg/mL in 20 mM di acetato di sodio.
AMBICIN (Lisostafina ricombinante)	AMBI	LSPN-50	Lisostafina recominante liofilizzata. Congelare a -80 °C per una conservazione a lungo termine.
COS - Colombia agar + 5% sangue di pecora	Biomerieux	Numero 43049	In alternativa, è possibile utilizzare qualsiasi piastra di agar adatta alla coltivazione di stafilococchi.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, alto glucosio con rosso fenolo	Sigma-Aldrich	D6429
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, alto glucosio senza rosso fenolo	Sigma-Aldrich	D1145
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco con MgCl2 e CaCl2, filtrata sterile	Sigma-Aldrich	D8662
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, filtrata sterile	Sigma-Aldrich	D8537
Easyspiral diluito	Interscienza	Numero 414000	Diluitore automatico e piatto a spirale
Siero fetale bovino	Gibco	Codice 10270-106
Proteinasi K, ricombinante 20 mg/mL	Eurobio	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg, lotto 901727
Scansione 4000	Interscienza	Numero 438000	Contatore automatico di colonie
Acqua sterile	OTEC	Codice 600500
TC20 Contatore automatico di celle	Biorad	1450102	Contacellule automatico
Tris 1 M pH 8.0	Invitrogen	AM9855G	Utilizzato per preparare la soluzione di lavoro della lisostafina a 1 mg/mL in Tris-HCl 0,1 M.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tripsina - Soluzione EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	0,05% tripsina suina e 0,02% EDTA in soluzione salina bilanciata di Hanks con rosso fenolo
Microscopio a fluorescenza ad ampio campo	Nikon	Ti2