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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE
1. Preparazione della soluzione
NOTA: Maneggia e prepara tutti i reagenti e le soluzioni con vetreria senza ferro o plastica usa e getta. Evitare che materiali metallici di laboratorio (ad es. spatole in acciaio inossidabile) entrino in contatto con reagenti o soluzioni, a causa del rischio di contaminazione da ferro. Assicurati che tutti i bicchieri riutilizzabili siano privi di ferro. Lavare i materiali con un detergente da laboratorio appropriato per 30-60 minuti, risciacquare con acqua deionizzata, immergerli per una notte in una soluzione di acido nitrico al 37% diluita 1:3 con acqua deionizzata, risciacquare nuovamente con acqua deionizzata e lasciare asciugare.
- Miscela acida: aggiungere 10 g di acido tricloroacetico a 82,2 ml di acido cloridrico al 37% in una bottiglia di vetro, sciogliere accuratamente e regolare il volume finale a 100 ml con acqua deionizzata. Agitare prima dell'uso. In alternativa, utilizzare solo acido cloridrico al 37% per la digestione dei tessuti.
nota: La soluzione è stabile per almeno 2 mesi se conservata in flaconi di reagenti di vetro marrone scuro.
cautela: L'acido cloridrico e l'acido tricloroacetico sono corrosivi e le forme concentrate rilasciano vapori acidi tossici. Indossare sempre indumenti protettivi, guanti resistenti agli agenti chimici e occhiali antispruzzo di sostanze chimiche quando si maneggiano gli acidi. Evitare di inalarli e maneggiare sempre gli acidi sotto una cappa aspirante.
- Acetato di sodio saturo: aggiungere 228 g di acetato di sodio anidro a 400 ml di acqua deionizzata in una bottiglia di vetro e agitare per una notte a temperatura ambiente. Lasciare riposare la soluzione e precipitare per un giorno. Se non si verificano precipitazioni, continuare ad aggiungere piccole quantità di acetato di sodio. Conservare la soluzione in un flacone di vetro.
- Reagente cromogeno: Per preparare 1 ml di reagente cromogeno, aggiungere 1 mg di sale disodico dell'acido disolfonico 4,7-difenil-1,10-fenantrolina a 500 μL di acqua deionizzata e 10 μL di acido tioglicolico concentrato (100%) e sciogliere completamente. Portare il volume finale a 1 ml con acqua deionizzata.
nota: Preparare la quantità di reagente cromogeno necessaria. La soluzione è stabile per 1 mese se protetta dalla luce.
- Reagente cromogeno di lavoro (WCR): Aggiungere 1 volume di reagente cromogeno a 5 volumi di acetato di sodio saturo e 5 volumi di acqua deionizzata.
nota: Questa soluzione deve essere preparata fresca il giorno dell'uso.
- Soluzione standard di ferro stock: per preparare una soluzione di ferro stock da 20 mM, porre 111,5 mg di polvere di ferro carbonilico in un matraccio tarato da 250 mL contenente 5.480 μL di acido cloridrico al 37%. Lasciare sciogliere per una notte a temperatura ambiente (o incubare a bagnomaria). Quindi, preparare la soluzione fino a un volume finale di 100 ml con acqua deionizzata.
nota: La soluzione standard può essere conservata a tempo indeterminato se conservata in un recipiente ermeticamente chiuso.
- Working Iron Standard Solution (WISS): aggiungere 13,5 μl di acido cloridrico al 37% a 500 μl di acqua deionizzata. Aggiungere 10 μL della soluzione standard di ferro madre e portare il volume finale a 1 mL con acqua deionizzata (11,169 μg di Fe/mL, 200 μM; misurato da AAS).
nota: La soluzione di lavoro deve essere preparata fresca il giorno dell'uso.
2. Essiccazione del campione
- Tagliare un campione di tessuto del peso di 10-100 mg con una lama di bisturi. Pesarlo accuratamente in una bilancia analitica/di precisione su un piccolo pezzo di parafilm (peso fresco).
- Utilizzando una pinzetta di plastica, posizionare il pezzo di tessuto in una piastra a 24 pozzetti (senza coperchio per consentire l'evaporazione dell'acqua) e lasciarlo asciugare su un'incubatrice standard a 65 °C per 48 ore.
- In alternativa, utilizzare un forno da laboratorio per la digestione a microonde per essiccare i campioni di tessuto. Usando una pinzetta di plastica, metti il pezzo di tessuto pesato in una tazza di teflon senza ferro e asciugalo nel microonde. Impostare i parametri di funzionamento secondo il manuale di istruzioni dello strumento.
nota: A titolo di riferimento, i parametri operativi per l'essiccazione dei campioni di fegato utilizzando l'apposito forno di digestione (vedi Tabella dei materiali) sono riportati nella Tabella 1.
- Utilizzando una pinzetta di plastica, posizionare ogni pezzo di tessuto essiccato su un piccolo pezzo di parafilm all'interno di una bilancia analitica/di precisione e pesarlo accuratamente (peso secco).
3. Campione di digestione acida
- Utilizzando una pinzetta di plastica, trasferire ogni pezzo di tessuto essiccato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Aggiungere 1 mL della miscela acida e chiudere la provetta da microcentrifuga. Preparare un bianco acido allo stesso modo, tranne per il fatto che il tessuto viene omesso.
cautela: La miscela acida è corrosiva e rilascia vapori tossici. Indossare indumenti protettivi, guanti resistenti agli agenti chimici e occhiali antispruzzo di sostanze chimiche quando si maneggia la miscela acida. Evitare di inalarlo e maneggiarlo sempre sotto una cappa aspirante.
- Digerire i tessuti incubando le provette per microcentrifuga in un incubatore a 65 °C per 20 ore.
- Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, trasferire 500 μl dell'estratto acido limpido (giallo) (surnatante) in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando una micropipetta dotata di puntali in plastica. Se non è possibile ottenere un surnatante limpido, eseguire una breve centrifugazione spin.
cautela: Il surnatante è altamente acido. Indossare indumenti protettivi, guanti resistenti agli agenti chimici e occhiali antispruzzo di sostanze chimiche quando si maneggiano i surnatanti. Maneggiarli sempre sotto una cappa aspirante.
nota: A questo punto, gli estratti acidi possono essere immediatamente utilizzati per il test colorimetrico o congelati a -20 °C per un uso successivo. Scongelare completamente i campioni congelati a temperatura ambiente e agitarli prima dell'uso.
4. Sviluppo del colore
- Preparare le reazioni cromogene come indicato nella Tabella 2 in provette per microcentrifuga da 1,5 mL o, per una maggiore produttività, direttamente nelle micropiastre di polistirene trasparenti non trattate a fondo piatto, a 96 pozzetti. Preparare tutte le reazioni (bianco acido, standard e campione) almeno in duplicato.
- Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
5. Lettura dell'assorbanza
- Misura l'assorbanza del campione in uno spettrofotometro o in un lettore di piastre a una lunghezza d'onda di 535 nm rispetto a un riferimento di acqua deionizzata. Le lastre possono essere lette senza coperchio o con coperchio. Nella custodia con coperchio, rimuovere l'eventuale condensa formatasi a causa del rilascio di vapori acidi dal coperchio appena prima della misurazione per evitare possibili interferenze con la lettura dell'assorbanza.
nota: L'assorbanza ottica del bianco acido letto contro l'acqua deionizzata (riferimento) deve essere inferiore a 0,015; L'assorbanza ottica dello standard e dei campioni deve essere compresa tra 0,100 e 1,000. Per campioni con contenuto di ferro molto alto o molto basso, potrebbe essere necessario aggiustare i volumi dell'estratto acido (surnatante) e del diH2O (Tabella 2): se l'assorbanza è maggiore di 1,0, utilizzare un volume di campione (surnatante) inferiore; Quando l'assorbanza è inferiore a 0,1, utilizzare un volume maggiore di surnatante. Il volume del campione (Vsmp) viene preso in considerazione nel calcolo del contenuto di ferro nei tessuti di ciascun campione (vedere la fase 6).
6. Calcolo del contenuto di ferro nei tessuti
- Calcola il contenuto di ferro nei tessuti non eme con la seguente equazione:
Ferro tissutale (μg/g di tessuto secco) = Equazione 1
AT = assorbanza del campione da analizzare
AB = assorbanza del bianco acido
AS = assorbanza di standard
Fes = concentrazione di ferro di WISS (μg Fe/mL)
W = peso del tessuto secco (g)
Vsmp = volume del campione (volume variabile di surnatante nella Tabella 2 convertito in mL)
Vf = volume finale della miscela acida dopo l'incubazione notturna a 65 °C (corrispondente al volume dell'acido più il volume del tessuto secco in mL; se il peso del campione non differisce in modo significativo, assumere un volume costante ≈ 1 mL)
Vstd = volume standard di ferro (volume di WISS nella Tabella 2 convertito in mL)
Vrv = volume finale di reazione (volume totale nella Tabella 2 convertito in mL)
Tabella 1: Parametri operativi per l'essiccazione del fegato in un forno per digestione a microonde utilizzato qui
| Potenza 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Pressione (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Tempo (min): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Tempo di pressione (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ventilatore: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabella 2: Preparazione delle reazioni cromogene in provette da 1,5 mL o piastre da 96 pozzetti.
| | WCR (μL) | Miscela acida (μL) | Surnatante (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Volume totale (μL) |
| 1.5 mL di provette | Acido Blank | 1000 | 150 | | | 150 | 1300 |
| standard | 1000 | 150 | | 150 | | 1300 |
| campione | 1000 | | variabile | | variabile | 1300 |
| micropiastra a 96 pozzetti | Acido Blank | 150 | 22,5 | | | 22,5 | 195 |
| standard | 150 | 22,5 | | 22,5 | | 195 |
| campione | 150 | | variabile | | variabile | 195 |