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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Espansione dei progenitori OC
- Risospendere le PBMC in α-MEM completo (10% FBS, 1% Pen/Streptococco, 1% amfotericina B) contenente 20 ng/mL di m-CSF. Seminare PBMC a una densità di 2,5 x 105 cellule/cm2. Di solito, le cellule isolate da 15-20 ml di sangue fresco possono essere seminate in un pallone da 75 cm2 (1,5-2 x 107 cellule).
- Nutrire le cellule con α-MEM completo fresco contenente 20 ng/mL M-CSF ogni tre giorni fino a quando le cellule attaccate raggiungono la confluenza desiderata. Le rese tipiche sono 1,5-2 x106 celle/pallone quando le celle sono confluenti al 95%. Di solito, il periodo di espansione dura 6 giorni.
nota: Il potenziale osteoclastogenico dei precursori può diminuire con un tempo di coltivazione prolungato.
2. Induzione dell'osteoclastogenesi in piastre rivestite di fosfato di calcio
- Per facilitare l'adesione cellulare, incubare le piastre rivestite di fosfato di calcio (CaP) con 50 μL di FBS per 1 ora in un incubatore a 37 °C.
- Per staccare i precursori dell'OC, lavare due volte il pallone con PBS per rimuovere le cellule morte o non aderenti. Aggiungere 4 mL di tripsina (Tabella dei materiali) per 75 cm2 matraccia, per 30 min.
- Aggiungere 4 mL di α-MEM completo per fermare la digestione, staccare con cura le cellule utilizzando un raschietto cellulare e trasferire le cellule in una provetta da 50 mL.
- Determinare il numero totale di celle utilizzando una camera Neubauer o simile.
- Pellettare le cellule mediante centrifugazione per 7 minuti a 350 x g. Risospendere il pellet in una quantità sufficiente di α-MEM completo contenente 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL di RANKL per ottenere una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL.
- Aspirare la soluzione FBS dalla piastra a 96 pozzetti rivestita con CaP e pipettare 200 μL di sospensione cellulare per pozzetto (2 x 10,5 cellule/pozzetto).
- Incubare i precursori dell'OC per il periodo di tempo desiderato o con i reagenti desiderati rilevanti per il disegno sperimentale. Di solito, un numero elevato di OC grandi e multinucleati può essere osservato dopo 6 giorni e quando si formano pozzi di riassorbimento. Alimentare le celle con terreno α-MEM completo fresco contenente 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL ogni tre giorni.
- Al termine dell'incubazione, lavare due volte le cellule con PBS, fissare con paraformaldeide al 4% per 10 minuti e risciacquare nuovamente con PBS.
- Utilizzare gli OC fissi direttamente per la colorazione a fluorescenza o conservare a 4 °C.
3. Colorazione a fluorescenza di OC e rivestimento in fosfato di calcio
- Incubare le cellule fissate con tampone di permeabilizzazione (0,1% Triton in PBS) per 5 minuti.
- Colorare i filamenti di actina con 100 μL di soluzione di falloidina marcata con AlexaFluor 546 in PBS per 30 minuti e aspirare la soluzione colorante. Aggiungere 100 μl di soluzione colorante Hoechst 33342 (10 μg/mL in PBS) per 10 minuti per colorare i nuclei. È possibile utilizzare anche DAPI.
- Macchiare il rivestimento CaP con 100 μL di calceina 10 μM in PBS per 10 min. Lavare tre volte con PBS e scattare immagini.