L'uso di materiali radioattivi (RAM) richiede l'approvazione preventiva da parte di un comitato di sicurezza designato in ogni istituzione.
1. Preparazione di soluzioni madre per 14substrati marcati C
- Preparare 4 mM di soluzione madre di albumina sierica bovina (BSA) mescolando 11 g di BSA e 33,1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) e agitandola delicatamente a temperatura ambiente per ~3 ore fino a quando la BSA non è completamente disciolta. Riscaldare la soluzione madre BSA in un bagnomaria a 70 °C prima dell'uso.
- Asciugare all'aria 50 μCi 14C-oleato (50 μCi/μmol in etanolo) nel flaconcino con il coperchio aperto per 8 ore in una cappa di lavoro RAM designata. Aggiungere 312,5 μl di H2O e poi 3,5 mg (11,5 μmol) di oleato di sodio. Mescolare accuratamente.
- Riscaldare la soluzione risultante a 70 °C a bagnomaria. Aggiungere 0,9375 mL della soluzione madre BSA preriscaldata per ottenere 10 mM di soluzione madre di oleato caldo (contenente un rapporto 1:11,5 di 14C-oleato rispetto all'oleato non marcato). Aliquotare la soluzione madre e conservarla a -20 °C per un uso prolungato.
- Utilizzare 14C-glucosio e 14C-glutammina subito dopo lo scongelamento.
2. Preparazione del terreno contenente 14substrati marcati C
NOTA: Per garantire concentrazioni affidabili di substrati energetici nel mezzo, i mezzi su misura devono essere utilizzati con substrati freschi aggiunti poco prima dell'uso. In questo caso, viene utilizzato un mezzo minimo essenziale (MEMα) su misura senza glucosio, piruvato, glutammina, rosso fenolo o bicarbonato di sodio. Tuttavia, è necessario determinare un terreno ottimale per ogni tipo di cellula.
- Ricostituire 8,67 g di polvere media in 1 L di acqua purificata. Aggiungere 2,2 g di bicarbonato di sodio per ottenere un pH di 7,4 e filtrare la soluzione utilizzando una filtrazione sottovuoto a 0,22 μm.
- Aggiungere ingredienti freschi per ottenere il terreno completo (cMEMα) con concentrazioni finali di 5,5 mM di glucosio, 2 mM di glutammina, 1 mM di piruvato e 10% di siero fetale bovino (FBS). Integrare ulteriormente cMEMα con 100 mM di L-carnitina e 10 μM di HEPES per facilitare l'ossidazione degli acidi grassi.
- Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 14substrati marcati C a cMEMα appena preparato per ottenere terreni caldi. Per rendere l'oleato caldo, aggiungere la soluzione madre di oleato caldo da 10 mM a cMEMα per una concentrazione finale di 100 μM di oleato (diluizione 1:100, radioattività finale 0,4 μCi/mL).
nota: Il brodo di oleato caldo da 10 mM contenente un rapporto 1:11,5 di oleato caldo/freddo (vedi passaggio 1.3) viene utilizzato per raggiungere un livello fisiologico di 100 μM di oleato totale nel terreno, riducendo al minimo la quantità di materiale radioattivo.
- Preparare 10 mM di oleato non etichettato aggiungendo 24,36 mg di oleato di sodio a 2 mL di H2O in un bagno d'acqua a 70 °C per ~20 min fino a completa dissoluzione prima di mescolare rapidamente con 6 mL della soluzione madre BSA da 4 mM preriscaldata a 70 °C. Trasferire in un bagno d'acqua a 37 °C per 1 ora e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Aliquotare e conservare a -20 °C per un uso prolungato.
- Per rendere il glucosio un mezzo caldo, aggiungere 14C-glucosio a una concentrazione finale di 1,333 μM (diluizione 1:4.125, radioattività finale 0,4 μCi/mL). Per rendere la glutammina un mezzo caldo, aggiungere 14C-glutammina alla concentrazione finale di 2 μM (diluizione 1:1.000, radioattività finale 0,4 μCi/mL).
- Integrare il terreno caldo di glucosio e glutammina con una soluzione madre da 10 mM di oleato non marcato dal passaggio 2.4 per ottenere la concentrazione finale di 100 μM di oleato, la stessa di quella del mezzo caldo oleato.
3. Preparazione delle cellule
NOTA: I preosteoblasti calvari e i macrofagi del midollo osseo sono usati come esempi qui. Gli utenti devono preparare il tipo di cellula di scelta secondo i protocolli appropriati. Ottimizzare la concentrazione di collagenasi II da utilizzare per la digestione negli esperimenti pilota, poiché l'attività enzimatica può variare tra i diversi lotti.
- Isolamento e coltura dei preosteoblasti calvari
- Sacrificare i cuccioli del giorno 3-5 (P3-5) dopo la nascita mediante decapitazione e trasferirli in DPBS ghiacciati contenenti penicillina-streptomicina (P/S).
- Esporre la calvaria rimuovendo la pelle e i tessuti molli. Raccogliere la regione centrale tagliando via i tessuti circostanti da dietro in avanti in DPBS (Figura 1A). Grattare delicatamente le superfici interne ed esterne della calvaria usando una pinzetta per aiutare a rilasciare le cellule dopo la successiva digestione.
- Preparare una soluzione da 2 mg/mL e una soluzione da 4 mg/mL di Collagenasi di tipo II in DPBS e filtrare ciascuna soluzione con un filtro fresco da 0,22 μm. Digerire prima la calvaria pulita con la soluzione di collagenasi da 2 mg/mL per 15 minuti ed eliminare la soluzione digestiva. Digerire i campioni puliti in una soluzione di collagenasi da 4 mg/mL 3 volte per 15 minuti ogni volta, accumulando e conservando la soluzione digestiva.
- Filtrare la soluzione di digestione attraverso filtri cellulari da 70 μm e centrifugare il filtrato a 300 × g per 5 minuti. Risospendere il pellet cellulare in cMEMα (vedere passaggio 2.2) contenente il 10% di FBS e P/S.
- Contare e seminare le cellule a 4 × 104 cellule/cm2 in piastre da 10 cm. Coltura delle cellule in un incubatore a 37 °C con CO2 al 5% per 3 giorni.
- Dissociare le cellule a 37 °C con tripsina-EDTA allo 0,25%. Contare e seminare le cellule in piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti con cMEMα contenente il 10% di FBS e P/S a 7,5 × 105/cm2. Seminare almeno 4 pozzetti per tipo di cellula per substrato e almeno tre pozzetti extra per ogni tipo di cellula per il conteggio delle cellule prima del saggio.
- Coltura delle cellule a 37 °C per una notte prima dei saggi di ossidazione del substrato.
- Isolamento e coltura dei BMM
NOTA: La coltura di BMM richiede un fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), che può essere acquistato commercialmente come proteina ricombinante. Il terreno condizionato della linea cellulare CMG14-12 progettato per esprimere M-CSF è un'alternativa economica utilizzata in questo caso.
- Raccogli femori e tibie da topi di 8 settimane dopo aver rimosso il muscolo e i tessuti connettivi. Taglia e scarta entrambe le estremità delle ossa con le forbici affilate.
- Sciacquare il midollo osseo da un femore e una tibia in una piastra di Petri da 10 cm con una siringa dotata di un ago da 23 G contenente 15 ml di cMEMα con il 10% di FBS, P/S e il 10% di terreno condizionato CMG14-12 (terreno BMM). Coltura delle cellule nella capsula di Petri in un incubatore a 37 °C con CO2 al 5%.
- Dopo 3 giorni, eliminare il terreno di coltura e risciacquare con DPBS. Dissociare le cellule attaccate a 37 °C con tripsina-EDTA allo 0,25% per 5 minuti. Centrifugare e risospendere il pellet della cella nel mezzo BMM.
- Contare e seminare le cellule in piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti a 7,5 × 105/cm2 secondo le stesse modalità descritte al punto 3.1.6. Coltura a 37 °C per una notte nel terreno BMM prima di iniziare i saggi.
4. Saggio di ossidazione del substrato con trappola di CO2
NOTA: È necessario determinare una densità di semina appropriata per ogni tipo di cella per raggiungere l'80-90% di confluenza prima dell'inizio del saggio. Si noti che la densità cellulare può influenzare lo stato metabolico delle cellule.
- Lavare due volte le celle nei pozzetti extra con DPBS. Dissociare le cellule con tripsina-EDTA allo 0,25% e cellule miste da 20 μL risospese in DPBS con 20 μL di soluzione colorante commerciale pronta all'uso di arancio/ioduro di propidio (AO/PI) di acridina. Determina il numero di cellule vive con un contatore di celle automatizzato e registra il numero per i calcoli finali.
- Lavare due volte le cellule nei pozzetti del saggio con DPBS. Aggiungere 500 μl di terreno caldo a ciascun pozzetto del saggio nella cappa di coltura tissutale designata RAM. Sigillare le piastre con parafilm e incubare le cellule in un incubatore designato come RAM a 37 °C per 4 ore.
- Durante l'incubazione, tagliare la carta da filtro in pezzi circolari leggermente più grandi dell'area all'interno del tappo delle provette per microcentrifuga da 1,5 ml e inserire la carta comodamente nel tappo (Figura 1B). Aggiungere 200 μl di acido perclorico 1 M a ciascuna provetta e 20 μl di idrossido di sodio alla carta da filtro inserita all'interno del tappo.
- Dopo l'incubazione delle cellule, trasferire 400 μl di terreno di coltura da ciascun pozzetto alle provette preparate e chiudere immediatamente i tappi. Lasciare le provette in una griglia portaprovette a temperatura ambiente per 1 ora.
- Durante l'incubazione, preparare una fiala di scintillazione per ogni provetta e riempirla con 4 mL di liquido di scintillazione. Trasferire ogni pezzo di carta da filtro in una fiala di scintillazione e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Eseguire i test di pulizia sulla cappa di coltura tissutale, sul bagno d'acqua (utilizzato per la preparazione di 14C-oleato), sul frigorifero, sull'incubatrice, sul lavandino, sul terreno e su qualsiasi altra area di lavoro per verificare la potenziale contaminazione da RAM. Mettere le salviette di carta in fiale di scintillazione contenenti liquido di scintillazione.
- Misurare la radioattività a 14C nelle fiale di scintillazione con un contatore di scintillazione. Registrare i risultati della lettura. Se necessario, decontaminare l'ambiente di lavoro secondo le linee guida sulla sicurezza dalle radiazioni.
