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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE
1. Preparazione del LED per l'illuminazione a luce blu
- Accendere un pannello LED utilizzando l'applicazione associata installata su un tablet/telefono. Inserire la sonda di uno spettrometro in un pozzetto vuoto di una parabola a 6 pozzetti e regolare la luce LED sulla lunghezza d'onda con un picco di ~456 nm attraverso l'applicazione. Posizionare il sensore ottico di un misuratore di potenza ottica nel pozzetto vuoto e regolare la potenza della luce LED (~0,61 mW/cm2). L'impostazione della luce LED può essere salvata ed è recuperabile nell'applicazione.
- Introdurre l'impostazione della parabola/pannello LED nell'incubatrice a 28 °C. Completare questo passaggio prima che l'imaging dei pesci inizi a 48 hpf.
2. Imaging di larve di pesce zebra che esprimono TDP-43 optogenetico
- Selezionare Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] pesci a doppia transgenica almeno prima di 47 hpf, in base alla fluorescenza RFP (opTDP-43h) o EGFP (EGFP-TDP-43z) nella colonna motoria spinale utilizzando il microscopio a epifluorescenza dotato di una lente obiettivo Plan-Neofluar 5x/0.15.
- Dechorionate il Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] pesce doppio transgenico.
- Preriscaldare l'agarosio all'1% a bassa temperatura di fusione contenente 250 μg/mL di sale di etil 3-amminobenzoato metansolfonato a 42 °C.
- Anestetizzare brevemente Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] pesci a doppia transgenica a 48 hpf in tampone E3 contenente la stessa concentrazione di Tricane.
- Mettere una goccia di agarosio preriscaldato all'1% a bassa temperatura di fusione sulla base di vetro a temperatura ambiente. Il diametro della goccia di agarosio a forma di cupola sul piatto di vetro è di 8-10 mm.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere il pesce anestetizzato all'agarosio a bassa temperatura di fusione sul piatto di base in vetro, quindi mescolare pipettando alcune volte. Ridurre al minimo la quantità di tampone E3 aggiunta all'agarosio insieme al pesce.
- Mantenere il pesce su un lato utilizzando un ago da siringa durante la solidificazione dell'agarosio (in genere ~1 minuto) per assicurarsi che il midollo spinale sia in una posizione orizzontale appropriata. Dopo la solidificazione, mettere un paio di gocce di tampone E3 sul pesce montato in agarosio a forma di cupola.
- Acquisizione di sezioni z confocali seriali del midollo spinale mediante scansione con un microscopio confocale dotato di un obiettivo a immersione in acqua 20x con apertura numerica di 1,00, utilizzando una velocità di scansione di 4,0 μs per pixel (12 bit per pixel), una dimensione del passo di 1,0 μm per fetta per l'obiettivo e una combinazione di lunghezze d'onda di eccitazione/emissione: Canale 1) 473/510 nm per EGFP e canale 2) 559/583 nm per mRFP1.
nota: La cloaca sul lato ventrale del pesce è inclusa nelle regioni di interesse (ROI) come riferimento, il che aiuta a identificare e confrontare i segmenti spinali (livelli 16-17) attraverso i punti temporali.
- Rimuovere il pesce dall'agarosio rompendo accuratamente l'agarosio con un ago da siringa non appena l'imaging è completo. Mantenere il tempo di immersione del pesce nell'agarosio il più breve possibile, anche se l'incorporazione dell'agarosio per <30 minuti non influisce sulla vitalità del pesce.
3. Stimolazione luminosa di pesci che esprimono opTDP-43h mediante l'illuminazione sul campo di una luce a diodi emettitori di luce blu (LED)
- Aggiungere 7,5 mL di tampone E3 al pozzetto e posizionare il pesce doppio transgenico Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] nel pozzetto. Posizionare la parabola a sei pozzetti sul pannello LED mantenendo la parabola e il pannello LED a 5 mm di distanza con un distanziatore (ad esample, con cinque vetrini impilati).
- Accendi la luce LED blu. Conservare alcuni dei pesci Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] a doppia transgenica in un piatto separato a sei pozzetti coperto con un foglio di alluminio quando sono necessari pesci di controllo non illuminati (cioè in condizioni di oscurità).
- Dopo l'illuminazione (ad esempio, per 24 ore a 72 hpf nella Figura 1), visualizzare il midollo spinale del pesce illuminato ripetendo i passaggi 2.3 - 2.9.
