Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE
1. Screening in vitro di piccole molecole
- Preparare le piastre di analisi seguendo i passaggi seguenti.
- Versare l'acqua distillata autoclavata in un trogolo sterile e, utilizzando una pipetta multicanale, erogare 40 μl di acqua distillata dal trogolo in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto.
- Preparare lo strumento di spillatura e aggiungere le sostanze chimiche.
- Posiziona i vassoi per pinner (vedi Tabella dei materiali) vicino alla fiamma di un bruciatore Bunsen su un banco da laboratorio. Aggiungere quanto segue ai vassoi successivi: 25 mL di soluzione per la pulizia dei pinner, 35 mL di DMSO al 50% (in acqua), 45 mL di acqua distillata, 55 mL di EtOH al 70% e 65 mL di EtOH al 95%. Posizionare un foglio di carta assorbente davanti a ciascun vassoio.
- Pulire lo strumento di bloccaggio immergendo i perni nella soluzione detergente e muovendo i perni su e giù tre volte (3x) nella soluzione. In questo protocollo, '3x' e '10x' sono definiti come lo spostamento del pinner su e giù in una soluzione rispettivamente tre o dieci volte. Tampona gli spilli sulla carta assorbente. Ripetere questa procedura ancora una volta.
- Quindi, sciacquare gli spilli 3 volte in acqua distillata, quindi asciugarli. Ripetere la procedura ancora una volta.
- Infine, sciacquare gli spilli 3 volte in EtOH al 95%, quindi tamponare gli spilli. Ripeti ancora una volta. Fiammeggiare la matrice e lasciare evaporare l'etanolo.
- Aggiungere le sostanze chimiche dalle piastre di riserva chimiche a 96 pozzetti alle piastre di analisi fissando 3 volte nella piastra chimica, quindi trasferendo i perni 10 volte nella piastra di analisi. Tamponare sulla carta davanti alla soluzione detergente.
- Pulire lo strumento di spillatura tra le piastre lavando nel seguente ordine, tamponando tra una spruzzatura e l'altra su carta assorbente: 3 volte in DMSO al 50% (una volta), 3 volte in acqua distillata (una volta), 3 volte in EtOH al 75% (una volta), 3 volte in EtOH al 95% (due volte). Fiammeggiare il pinner e lasciare evaporare l'etanolo.
- Ripetere il passaggio 1.2.2 quando tutto il blocco è completato.
nota: Lo screening è stato eseguito ad una concentrazione finale di 60 μM.
- Aggiunta di vermi
- Contare il numero di nematodi dalla raccolta prima risospendendo e poi pipettando 5 μl utilizzando puntali a bassa ritenzione su un vetrino per l'osservazione. Contare il numero di nematodi in 5 μl utilizzando un microscopio da dissezione.
- Regolare la concentrazione a 2 vermi/μL utilizzando acqua distillata sterile. Utilizzando una pipetta multicanale e un trogolo, aggiungere 10 μL (~20 vermi) a ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti.
nota: Saranno raccolti circa 15.000 nematodi D. dipsaci per piastra di coltura utilizzando il metodo di coltura e raccolta descritto. Vengono utilizzati venti worm per pozzo perché il numero ridotto facilita la visualizzazione e la contabilizzazione chiara di quelli mobili e immobili.
- Sigillare le piastre nella pellicola da laboratorio e avvolgerle con un tovagliolo di carta umido. Mettere nella scatola e applicare su un tampone adesivo in un'incubatrice con agitazione a 20°C impostata a 200 giri/min. Assicurarsi che le piastre siano stabilizzate nella scatola aggiungendo un extra damp tovagliolo di carta per garantire un movimento minimo delle piastre.
2. Raccolta e analisi dei dati
- Osservare le piastre il giorno 5 con un microscopio da dissezione. Contare il numero di D. dipsaci mobili e il numero totale di D. dipsaci nei controlli con solventi DMSO e nei pozzetti trattati con farmaci.
- Se i vermi sono relativamente immobili, aggiungere 2 μL di NaOH 1 M a una concentrazione finale di 40 mM nel pozzetto per stimolare il movimento.
nota: Dopo aver aggiunto NaOH, i vermi si muoveranno istantaneamente e dovranno essere visualizzati entro 5 minuti. Il numero di worm mobili e il numero totale di worm verranno utilizzati per calcolare la percentuale di worm mobili. La lunghezza del test può variare a seconda dell'obiettivo dello schermo.
- Calcola la percentuale di worm mobili. Negli schermi di D. dipsaci, i pozzetti che hanno prodotto in modo riproducibile lo 0% di worm mobili sono classificati come colpi forti.
nota: Si evita l'esposizione prolungata delle lastre sul tavolino dei microscopi di dissezione perché la sorgente luminosa può riscaldare le piastre e indurre effetti variabili sul biotest.
