Saggio di mineralizzazione in vitro: un metodo colorimetrico per quantificare i depositi di calcio degli osteoblasti sul sostituto dell'innesto osseo mediante colorazione ed estrazione del rosso di alizarina

Abstract

Fonte: Kampleitner, C. et al. Profilo di compatibilità biologica sui biomateriali per la rigenerazione ossea. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, descriviamo un metodo per la rilevazione dei depositi di calcio secreti dagli osteoblasti utilizzando un colorante anionico, Alizarin Red S. Gli osteoblasti in coltura vengono prima colorati e quindi il colorante viene recuperato per la quantificazione colorimetrica dei depositi di calcio o del grado di mineralizzazione degli osteoblasti.

Protocollo

1. Saggio di mineralizzazione degli osteoblasti

1. Pre-incubare dischi di β-fosfato tricalcico (β-TCP) da 14 mm di diametro in 1 mL di terreno di crescita ossea (BGM) in una piastra di coltura in sospensione a 24 pozzetti a 37 °C e CO₂ al 5% per 24 ore prima di aggiungere gli osteoblasti (OB). Utilizzare piastre di coltura tissutale standard per i controlli e piastre di coltura in sospensione per i campioni di biomateriale per evitare l'adesione delle cellule alla plastica.
2. Aspirare il terreno di pre-incubazione e quindi risospendere gli OB primari di topo in BGM. Aggiungere 8,8 x 10⁴ OB/cm² sui dischi β-TCP pre-incubati in una piastra di coltura in sospensione a 24 pozzetti e, per il gruppo di controllo, in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti (1 mL/pozzetto). Gli OB si attaccheranno alla piastra di coltura tissutale o al campione di biomateriale.
3. Sostituire la BGM con 1 mL di terreno di mineralizzazione osteogenico (MM) contenente BGM, 50 μg/mL di acido ascorbico e 5 mM di β-glicerofosfato 24 ore dopo l'aggiunta delle OB e incubare per 14 giorni a 37 °C e 5% di CO₂. Cambiare il terreno ogni 2-3 giorni con 1 ml di MM appena preparato in ogni pozzetto.

2. Mineralizzazione degli osteoblasti valutata mediante colorazione con Alizarin Red S (ARS)

1. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti contenenti OB primari 14 giorni dopo l'aggiunta di MM e risciacquare due volte con 0,5 mL di 1x PBS a RT. Aspirare il PBS e fissare le cellule aggiungendo 0,5 mL della soluzione di formalina tamponata al 10% a RT per 10 minuti.
2. Aspirare la formalina tamponata al 10% con una pipetta monouso e lavare due volte con 0,5 ml di acqua ultrapura.
3. Agli OB fissati, aggiungere 0,25 mL di soluzione colorante ARS 40 mM (pH 4,2) disciolta in acqua ultrapura e incubare la piastra a RT per 10 minuti su un agitatore a 100 agitazioni/min.
4. Aspirare la soluzione colorante con una pipetta monouso e risciacquare con 1 ml di acqua ultrapura. Ripetere questo passaggio 5-10 volte per rimuovere le macchie non specifiche.
   nota: La soluzione di risciacquo deve essere priva di colore.
5. Aspirare l'acqua ultrapura e aggiungere 1 ml di PBS freddo. Incubare la piastra a RT per 10 minuti su uno shaker a 100 agitazioni/min.
6. Aspirare il PBS, trasferire i dischi β-TCP colorati in un nuovo pozzetto e scansionare le piastre con uno scanner piano per registrare la mineralizzazione.
7. Aggiungere 0,25 mL di soluzione di cloruro di cetilpiridinio al 10% e incubare la piastra a RT per 15 minuti su un agitatore a 100 agitazioni/min per estrarre il colorante ARS.
8. Trasferire i surnatanti in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 17.000 x g per 5 minuti a RT.
9. Aggiungere una soluzione di cloruro di cetilpiridinio al 10% agli estratti con un rapporto di diluizione di 1:10-1:20 e aggiungere i campioni (300 μl) in una piastra a 96 pozzetti che include due pozzetti vuoti contenenti solo il 10% di cloruro di cetilpiridinio.
10. Preparare 7 standard di riferimento ARS che vanno da 4 a 400 μM diluendo la soluzione di colorazione ARS da 40 mM (pH 4,2) con una soluzione di cloruro di cetilpiridinio al 10% per generare una curva standard.
11. Aggiungere 300 μl dello standard di riferimento in duplicati alla piastra a 96 pozzetti.
12. Leggere l'assorbanza dei campioni, dei bianchi e degli standard di riferimento a 520 nm.
13. Sottrarre le letture in bianco dagli standard di riferimento e dalle letture campione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
dischi di fosfato tricalcico β (β-TCP, 14 mm)			I dischi sono stati sinterizzati in un forno a muffola a una temperatura di 1150 °C. I campioni sono stati irradiati con raggi UV (15 minuti per lato) prima di essere utilizzati in colture cellulari
Alizarina Rosso S	Sigma-Aldrich	Codice: A5533
Terreno di crescita ossea (BGM)			α-MEM + 10% FBS inattivato a caldo + 1% penicillina/streptomicina
Soluzione di formalina tamponata neutra 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Esadecilpirdinio (cetilpiridinio) cloruro monoidrato	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C9002
Acido L-ascorbico 2-fosfato sale di sesquimagnesio idrato	Sigma-Aldrich	Codice: A8960
MEM alfa medio (α-MEM)	Tecnologie Gibco Life	Codice 11900-073
Terreno di mineralizzazione osteogenico (MM)			α-MEM + 10% FBS inattivato termicamente + 1% penicillina-streptomicina + 50 μg/mL di acido ascorbico + 5 mM β-glicerofosfato
Penicillina-streptomicina	Sigma-Aldrich	P4333
Soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
β-glicerofosfato sale disodico idrato	Sigma-Aldrich	G5422
Acqua ultrapura: Acqua di coltura cellulare apirogena	VWR	L0970-500
Piastra trasparente a 96 pozzetti	Greiner bio-one	655001
Piastra di coltura in sospensione a 24 pozzetti	Greiner bio-one	662102
piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti	Greiner bio-one	Codice 662160
Centrifuga: VWR Mega Star 600R	VWR
Incubatore a CO2: HeraCell 240	Termo Scientifico
Scanner piano: Epson Perfection 1200 Photo	Epson
Lettore di micropiastre Infinite M200 Pro	Tecan
Provetta per microcentrifuga: Eppendorf tube safe-lock 1,5 mL	VWR	Codice 21008-959
Incubatrice a scuotimento GFL3032	GFL	3032
Pipetta monouso: pipetta per siero	Greiner bio-one	612301