1. Preparazione delle perle per l'impianto di gel
- Prelevare una coltura contenente microsfere portanti rivestite con cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) e periciti.
- Esaminare al microscopio le piastre contenenti le microsfere rivestite di microcarrier utilizzando l'obiettivo 20X per assicurarsi che tutte le perle siano state sufficientemente rivestite dalle cellule endoteliali.
- Pipettare energicamente la soluzione di cellule piastrate per staccarle dalla piastra di 6 cm e posizionare la soluzione in una provetta. Lavare la piastra altre 2 volte con un mezzo completo e trasferirla nella provetta per raccogliere tutte le perle residue che possono aderire alla piastra.
- Evitare l'introduzione di bolle d'aria e utilizzare una pipetta p1000 per ridurre al minimo lo stress da taglio sulle perle rivestite di cellule endoteliali.
- Attendere 3 minuti per consentire alle perle della soluzione di depositarsi sul fondo del tubo.
- Rimuovere la maggior parte possibile del surnatante senza disturbare il pellet di perlina utilizzando un puntale per pipetta p1000 (non utilizzare un aspiratore a vuoto).
- Aggiungere 1 mL di terreno completo a ciascuna provetta e risospendere le perline.
- Attendere 30-60 s per consentire alle perline di depositarsi sul fondo. Quindi rimuovere la maggior parte possibile del surnatante utilizzando una pipetta P1000 senza disturbare il pellet del microsfera. Non utilizzare un aspiratore a vuoto poiché la probabilità di rimuovere accidentalmente il pellet di perline aumenta notevolmente.
- Ripetere i passaggi 1.6 e 1.7 altre due volte. L'obiettivo è quello di rimuovere il più possibile l'HUVEC fluttuante che potrebbe essere stato staccato dalla piastra di 6 cm, senza rimuovere troppe perle rivestite di HUVEC, che dovrebbero depositarsi nelle provette FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) a fondo tondo più rapidamente rispetto alle celle flottanti.
- Aggiungere 1 mL di terreno completo alle perline.
2. Incorporare Perline Rivestite in un Gel di Fibrina
- Rimuovere la maggior quantità possibile di terreno senza disturbare il pellet di perline in ciascuna provetta FACS utilizzando una pipetta P1000.
- Risospendere le perle in 2,5 mL di soluzione di fibrinogeno.
- Pipettare 13 μL di soluzione di trombina in ciascun pozzetto desiderato di una piastra a 24 pozzetti con fondo di vetro. La placcatura in una lastra con fondo di vetro è essenziale per consentire un'imaging ottimale dei germogli.
NOTA: Non lasciare la trombina in un pozzetto per più di 5-10 minuti prima del passaggio successivo.
- Aggiungere 0,5 mL di soluzione di perline/fibrinogeno in ciascun pozzetto.
- Assicurarsi di risospendere bene la soluzione del microsnodo prima di pipettare la soluzione ogni volta.
- Prestare attenzione a pipettare con cura direttamente nella trombina già presente nel pozzetto. Pipettare lentamente su e giù 2-3 volte per mescolare accuratamente la soluzione, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.
- Assicurarsi di cambiare il puntale della pipetta tra i pozzetti.
- Prestare attenzione a non muovere o disturbare la piastra in nessun momento durante la coagulazione iniziale della fibrina, poiché qualsiasi movimento potrebbe interrompere la formazione del gel.
- Lasciare riposare la piastra nella cappa per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferire con cautela la piastra in un'incubatrice a 37 °C per altre 1,5-2 ore per consentire al gel di solidificarsi completamente
3. Placcatura dei fibroblasti sopra il gel di fibrina
- Durante gli ultimi 30 minuti di solidificazione del gel, staccare i fibroblasti polmonari umani normali (NHLF) come segue:
- Lavare un matraccio T175 di cellule con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), quindi aggiungere 5 mL di soluzione per il distacco delle cellule e incubare a 37 °C per 10 min.
- Risospendere NHLF a una concentrazione di 20.000 cellule/mL in terreno completo.
NOTA: Le cellule NHLF possono essere coltivate con Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina streptomicina.
- Piastra 1 mL di sospensione cellulare NHLF sul gel di ciascun pozzetto e riposizionala nell'incubatore.
- Sostituire il terreno completo a giorni alterni per tutta la durata del test.
