1. Saggio di contatto larvale (dosaggio a punto singolo o saggio dose-risposta)
NOTA: Il test può essere condotto con sostanze chimiche solubili in acqua o dimetilsolfossido (DMSO), a condizione che la concentrazione finale di DMSO nei pozzetti di prova non superi l'1%. I solventi alternativi possono essere un'opzione, ma è essenziale confermare prima che la concentrazione finale non causi più del 10% di mortalità a 72 ore dopo l'esposizione. Il test può essere eseguito come dosaggio a punto singolo o dosaggio-risposta. In quest'ultimo caso, si consiglia di testare un intervallo di concentrazioni (minimo di cinque), che si estende sulla LC50 prevista.
- Etichettare i pozzetti di una piastra di tessuto trasparente a 24 pozzetti.
- Preparare una soluzione madre della sostanza chimica in esame in una provetta da 1,5 mL.
- Pesare ogni prodotto chimico utilizzando una bilancia analitica e, a seconda delle caratteristiche di solubilità, risospendere in ddH2O, DMSO o un altro solvente organico adatto a scelta.
nota: I calcoli dovrebbero tenere conto della purezza della chimica. Ad esempio, per una chimica pura al 99%, sciogliere 10,1 mg in 1.000 μl di acetone per ottenere una soluzione all'1%. Sigillare con pellicola di paraffina e conservare a -20 °C.
- Determinare la concentrazione finale della sostanza chimica in esame che verrà valutata e preparare di conseguenza diluizioni seriali dalla soluzione madre, utilizzando il solvente appropriato.
nota: La concentrazione e il volume della chimica e del solvente possono essere calcolati utilizzando la formula C1*V1=C2*V2 dove C1=concentrazione del campione 1, C2=concentrazione del campione 2, V1=volume del campione 1 e V2=volume del campione 2.
- Preparare una soluzione madre da 10 mM e le diluizioni seriali necessarie per ottenere le concentrazioni di prova desiderate (Tabella 1B).
- Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica a foro largo, trasferire cinque larve L3 nel pozzetto di una piastra per colture tissutali; Le larve L3 possono essere riconosciute dalla lunghezza (~ 2,5 - 3,5 mm) e dalla larghezza della capsula della testa di ~ 0,025 mm. Rimuovere delicatamente l'acqua con una pipetta da 1 ml e sostituirla con il volume desiderato di ddH2O. Ripetere per ottenere n = 4 repliche tecniche per trattamento (cioè 20 larve totali per trattamento).
- Aggiungere il volume appropriato di chimica di prova a ciascuno dei quattro pozzetti di replica nella piastra di prova a 24 pozzetti e agitare delicatamente la piastra per garantire una miscelazione uniforme della chimica. Collocare la piastra in una camera di prova o di crescita in condizioni costanti (ad esempio, si consiglia di utilizzare 25 °C e ~ 75-85% di umidità relativa e, se possibile, un ciclo di 12 ore di luce/12 ore di buio).
nota: Per la riproducibilità tra gli esperimenti, assicurarsi che i saggi successivi vengano eseguiti nelle stesse condizioni ambientali.
- Registrare il numero di larve morte/non responsivi in ciascun pozzetto a 30 minuti, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 e 72 ore dopo l'esposizione (o punti temporali alternativi) sul foglio dei punteggi (Tabella 2). Picchiettare delicatamente il lato della piastra. Se non si osserva alcun movimento, toccare delicatamente la larva con uno stuzzicadenti sterile. Segna le larve che non rispondono al picchiettamento/tocco come "morte".
nota: Altri fenotipi morfologici e comportamentali possono essere osservati e possono essere registrati.
- Correggere la mortalità di controllo utilizzando la formula di Abbott modificata, se lo si desidera, come segue:
Mortalità (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
dove X = la percentuale di mortalità nel campione trattato e Y = la percentuale di mortalità nel controllo.
- Rappresenta graficamente i risultati sotto forma di istogramma o curva logaritmica utilizzando un software a scelta come Graph-pad Prism 6 o simili e calcola i valori di concentrazione letale (LC) relativi al controllo.
- Ripetere il test utilizzando un lotto separato di zanzare per ottenere n = 3 o più repliche biologiche.
Tabella 1. Esempi di calcoli per il test di dose a punto singolo larvale (A) di Aedes aegypti L3 e il test dose-risposta (B).
| A. Saggi a dose singola con tre sostanze chimiche |
| chimica | Concentrazione (400 uM) |
| Amitriptilina | 80 mM Stock: 2 mg di amitriptilina X 98% (purezza della polvere) X 0,001 g/1 mg X 1 mol /313,86 g X 1 L/0,08 mol X 106 μL/L = 78,06 μL di acqua. |
| Diluizioni seriali: Diluire il materiale 1:2 con ddH2O e poi 1:4 per ottenere 10 mM. Aggiungere 40 μL di 10 mM di stock al pozzetto contenente 960 μL di ddH20 per ottenere una concentrazione finale di 400 μM/pozzetto. Preparare diluizioni seriali di 10 mM di stock 1:2 per ottenere stock da 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM e 0,625 mM. |
| Cis-(z)-flupenthixol | 80 mM Stock: 2 mg di cis(z)flupentixolo X 98% (purezza della polvere) X 0,001 g/1 mg X 1 mol/507,44 g cis(z)flupentixolo X 1L/0,08 mol X 106 μL/L = 48,28 μL di acqua. |
| Diluizioni seriali: Come sopra. |
| Amitraz | 80 mM Stock: 2 mg di Amitraz X 0,001 g/1 mg X 1 mol/293,4 g di amitraz X 1 L/0,08 mol X 106 μL/1 L = 85,21 μL di DMSO (nota: Amitraz è solubile solo in DMSO). |
| Diluizioni seriali: Come sopra. |
| B. Saggio dose-risposta |
| Chimica | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 |
| 400 μM | 200 μM | 100 μM | 50 μM | 25 μM |
| es., Amitriptilina, cis-(Z)-flupentixolo oramitraz | 40 μl | 40 μl | 40 μl | 40 μl | 40 μl |
| 10 mM di magazzino | 5 mM di magazzino | 2,5 mM di magazzino | 1,25 mM di azioni | 0,625 mM di magazzino |
Tabella 2. Esempio di foglio di valutazione utilizzato per registrare i dati del test dose-risposta delle larve di zanzara. Controllo, solo acqua o acqua con DMSO all'1% o solo altro solvente. Le dosi tipiche utilizzate per testare le sostanze chimiche antagoniste di piccole molecole come l'amitriptilina sono 25 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM e 400 μM.
| Saggio larvale L3 della zanzara |
| Data di inizio: |
| Investigatore: |
| Specie/Ceppo: |
| Tipo di test: Dose a punto singolo/risposta alla dose |
- Mortalità (n. zanzare morte)
| | |
| Tempo (ore) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | controllo |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| numero arabo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
- Percentuale di mortalità
|
| Tempo (ore) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | controllo |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| numero arabo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
