$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE
1. Cultura degli adulti zanzara
NOTA: I ceppi di zanzare suscettibili agli insetticidi sono disponibili nel Malaria Research and Reagent Reference Repository. I ceppi consigliati sono i seguenti: Ceppo Aedes aegypti Liverpool (LVP), Ceppo Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) e Ceppo Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB).
- Allevare larve di zanzara dalle uova con un ciclo di 12 ore giorno/12 ore notte a 28 °C e 75-85% di umidità relativa (UR) in vassoi di plastica da 25 cm x 40 cm (~ 400 larve per vassoio) come descritto da Nuss. Nutrire le larve con gerbillo di terra (A. aegypti e An. gambiae) o con cibo per pesci in scaglie (C. quinquefasciatus). Per i saggi larvali, raccogliere le larve al terzo stadio larvale (L3) di stadio.
- Allevare zanzare adulte da pupe che sono state trasferite in bicchieri di plastica e poste all'interno di gabbie di plastica da 20 L in un insetto nelle condizioni sopra descritte. Mantenere le zanzare con una soluzione di zucchero al 20% come descritto altrove. Raccogli gli adulti a 3-5 giorni dall'emergenza.
2. Saggio topico per adulti (dosaggio a punto singolo o saggio dose-risposta)
NOTA: Il test topico per adulti viene condotto utilizzando l'acetone come solvente. I solventi alternativi possono essere un'opzione, ma è essenziale confermare prima che la concentrazione finale non causi più del 10% di mortalità a 48 ore dopo l'esposizione. Il test può essere eseguito come dose a punto singolo o dosaggio-risposta e viene utilizzato per determinare la dose letale (LD). In quest'ultimo caso, si consiglia di testare un intervallo di concentrazioni (minimo di cinque), che si estende fino alla DL50 prevista.
- Determinare il numero di zanzare femmine adulte necessarie per completare il test.
nota: Un test a dose puntuale con una singola sostanza chimica richiederà un minimo di 90 zanzare (30 per il controllo positivo, 30 per il controllo negativo con solo acetone e 30 per la chimica in esame).
- Coltivare zanzare femmine adulte di 3-5 giorni e trasferirle in un secchio di plastica separato da 20 ml utilizzando un aspiratore (Figura 1).
- Etichettare i bicchieri di carta da 9 once con il nome e la concentrazione della sostanza chimica in esame. Mettere da parte quadrati di rete di 10 cm x 10 cm ed elastici per ogni tazza (vedi Figura 2).
- Selezionare un insetticida esistente come controllo positivo (ad esempio, il piretroide sintetico, bifentrin) e preparare una soluzione madre all'1% (10 μg/μL) in acetone.
NOTA: I calcoli devono tenere conto della purezza della chimica. Ad esempio, per una chimica pura al 99%, sciogliere 10,1 mg in 1.000 μl di acetone per ottenere una soluzione all'1%. Sigillare con pellicola di paraffina e conservare a -20 °C.
- Utilizzando la stessa procedura di cui sopra, preparare una soluzione madre della sostanza chimica in esame.
nota: Molti test chimici sono altamente labili e le soluzioni devono preferibilmente essere preparate fresche ogni volta che viene eseguito il biotest.
- Preparare diluizioni seriali del controllo positivo e testare le sostanze chimiche da soluzioni madre come mostrato nella Figura 3 utilizzando fiale di vetro da 20 mL precedentemente risciacquate con acetone.
- Spurgare una siringa di vetro da 1 ml con acetone, riempire con acetone e fissarla nel micro-applicatore regolato per erogare un volume di 0,25 μl.
- Lavorando in lotti di dieci, rimuovere le zanzare femmine adulte di 3-5 giorni dalle gabbie utilizzando un aspiratore e anestetizzarle per un massimo di cinque minuti a 4 °C in frigorifero o con ghiaccio. Quindi, trasferire le zanzare in una capsula di Petri e metterle sul ghiaccio per un massimo di 10 minuti.
- Lavorando rapidamente, rimuovere una singola femmina con una pinzetta sottile e applicare 0,25 μL di soluzione di prova sul torace dorsale utilizzando il micro-applicatore a siringa. Confermare la somministrazione della chimica mediante osservazione utilizzando un microscopio da dissezione per garantire che ogni zanzara riceva il volume appropriato di chimica di prova.
- Trasferisci la zanzara in un bicchiere di carta etichettato appoggiato sul ghiaccio e ripeti nove volte per ottenere n = 10 zanzare trattate. Sigillare le zanzare nella tazza con un quadrato a rete fissato con un elastico e trasferirle in una vasca di plastica o in una camera di crescita in condizioni costanti di 28 °C e 75-85% di umidità relativa (è preferibile un ciclo di 12 ore giorno/12 ore notturne).
- Ripetere l'esperimento di cui sopra due volte per ottenere n = 3 repliche tecniche (cioè 30 zanzare in totale) per trattamento o gruppo di controllo.
- Ripetere i passaggi 2.7 - 2.10 prima con la chimica di prova e poi con il controllo positivo.
nota: Un altro controllo utile da includere se sono disponibili un numero sufficiente di zanzare è un "vuoto" di 30 zanzare anestetizzate che non ricevono né la chimica del test né il solvente.
- Registrare il numero di zanzare "morte/non responsive" a 30 minuti, 60 minuti, 2, 24 e 48 ore dopo l'esposizione (o punti temporali alternativi) utilizzando il foglio dei punteggi (Tabella 1). Valutare le zanzare come "morte/non responsive" se mostrano mancanza di movimento, definite come sdraiate su un fianco o sulla schiena e con l'incapacità di volare.
- Se lo si desidera, correggere la mortalità di controllo utilizzando la formula di Abbott modificata come segue:
Mortalità (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
dove X = la percentuale di mortalità nel campione trattato e Y = la percentuale di mortalità nel controllo.
- Visualizza i risultati come istogramma o curva esponenziale. Per un test dose-risposta, calcolare il valore di LD50, LD75 o LD90 per la chimica di prova relativa al controllo.
- Ripetere il test almeno due volte utilizzando lotti separati di zanzare per ottenere n = 3 o più repliche biologiche.
