Test di alimentazione delle zanzare: un metodo per valutare gli effetti dei composti di prova sulla mortalità e la fecondità delle zanzare femmine adulte

Abstract

Fonte: Brito-Sierra, C. A. et al., Protocolli per testare la tossicità di nuovi prodotti chimici insetticidi per le zanzare. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra un test di alimentazione del sangue per valutare la mortalità e la fecondità dei composti in esame con nuove modalità d'azione sulle zanzare femmine. Questa tecnica aiuta nello screening di nuove classi di insetticidi per uccidere la popolazione resistente di zanzare e controllare la diffusione della malattia.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Saggio di alimentazione del sangue per adulti (dose a punto singolo o saggio dose-risposta)

1. Raccogli circa 150 zanzare femmine adulte di 4-5 giorni e trasferiscile in una gabbia separata. Ripetere per ottenere 6 gabbie se si esegue un test dose-risposta. Rimuovere la fonte di zucchero 1-24 ore prima del test di alimentazione.
2. Preparare una soluzione madre di chimica come descritto sopra, tenendo conto della purezza della chimica (una soluzione madre tipica è 80 mM in acqua o tampone salino), e successivamente preparare diluizioni seriali in acqua/tampone secondo necessità.
3. Aggiungere 40 μl di ciascuna delle diluizioni a 960 μl di sangue di coniglio defibrinato per ottenere la concentrazione di prova desiderata. Applicare il film di membrana su un'unità di alimentazione e sigillare con un anello di gomma. Trasferire 1 mL di sangue tramite pipetta e collegare l'unità di alimentazione a un'unità di riscaldamento.
4. Tamponare delicatamente la superficie della membrana con una soluzione di acido lattico al 10% appena preparata e posizionare l'unità di alimentazione nella gabbia delle zanzare adulte. Copri la gabbia con un panno scuro o un sacco della spazzatura nero e lascia che le zanzare si nutrano per un'ora.
5. Ripetere i passaggi 1.2 - 1.4 per il resto delle soluzioni di prova e il controllo negativo (solo sangue).
6. Al termine della poppata, mettere i secchi a 4 °C in frigorifero per 5 minuti per anestetizzare le zanzare. Rimuovere le zanzare maschi e le zanzare femmine non nutrite e contare e registrare il numero totale di zanzare nutrite e parzialmente alimentate mediante l'esame dell'addome.
7. Conservare le zanzare femmine parzialmente e completamente nutrite, puntando a un minimo di 50 zanzare alimentate con sangue per dose.
8. Trasferire i secchi in una vasca di plastica o in una camera di crescita in condizioni costanti di 28 °C e 75 - 85% di umidità relativa (è preferibile un ciclo di 12 ore giorno/12 ore notte).
9. Registrare il numero totale di zanzare morte/non responsibili a 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 e 72 ore (o punti temporali alternativi a seconda delle esigenze) utilizzando il foglio dei punteggi (Tabella 1).
10. Il terzo giorno dopo l'alimentazione del sangue, introdurre un portauova nella gabbia e raccogliere le uova per un periodo di 72 ore. Contare il numero totale di ovuli prodotti per trattamento al microscopio da dissezione.
11. Calcolare la percentuale di mortalità e fecondità in funzione del numero totale di zanzare alimentate per ciascun gruppo di trattamento e il controllo. Correggere la mortalità di controllo utilizzando la formula di Abbott modificata, se lo si desidera.
12. Visualizzare i dati di tossicità e fecondità sotto forma di istogramma, grafico o curva esponenziale (se si esegue un test dose-risposta) utilizzando un software di propria scelta. Se si esegue un test dose-risposta, calcolare il valore di LD₅₀, LD₇₅ o LD₉₀ per la chimica in esame relativa al controllo.
13. Ripetere il test almeno due volte utilizzando lotti separati di zanzare per ottenere n = 3 o più repliche biologiche.

Tabella 1. Esempio di foglio di valutazione utilizzato per registrare i dati del test di alimentazione del sangue negli adulti.Le dosi tipiche utilizzate per testare sostanze chimiche antagoniste di piccole molecole come l'amitriptilina sono 50 μM, 100 μM, 200 μM e 400 μM.

Mosquito Adult (3-5-day-old-old) Analisi topica
Data di inizio:
Investigatore:
Specie/Ceppo:
Tipo di test: Dose a punto singolo/dose-risposta
A. Mortalità (N. zanzare morte)
Tempo (ore)	Dose 1	Dose 2	Dose 3	Dose 4	Dose 5	controllo
0,5
1
1.5
numero arabo
2.5
B. Percentuale di mortalità
Tempo (ore)	Dose 1	Dose 2	Dose 3	Dose 4	Dose 5	controllo
0,5
1
1.5
numero arabo
2.5

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ceppi di zanzare sensibili agli insetticidi	Archivio di riferimento per la ricerca e i reagenti	https://www.beiresources.org/ MR4Home.aspx; Ceppi consigliati: Ceppo Aedes aegypti Liverpool (LVP), Ceppo Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) e Ceppo Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB)
Bifentrin	Sigma-Aldrich	CAS: 51529-01-2	Piretoride sintetico utilizzato come controllo positivo
Sangue di coniglio defibrato	Emostatico	DRB0100	Fonte di sangue per zanzare adattate all'alimentazione artificiale
Sistema di alimentazione a membrana Hemotek	Hemotek Ltd	Numero di serie 1303	Utilizzato per l'alimentazione delle zanzare
Pipette di trasferimento	Fisher Scientifico	13-711-7M U
Stereomicroscopio	Olimpo	SZ6045	Utilizzato per valutare saggi larvali ed eseguire microapplicazioni
Pinzette (fine)	Fontax		Utilizzato per gestire le zanzare adulte
Bicchieri di carta	Prodotti di consumo Dixie LLC.	PF15675/13D	Utilizzato per conservare le zanzare adulte in saggi topici per adulti
Elastici di vantaggio	Alleanza Rubber Co.		Utilizzato per sigillare i bicchieri di carta

per la malaria