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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Saggio di alimentazione del sangue per adulti (dose a punto singolo o saggio dose-risposta)
- Raccogli circa 150 zanzare femmine adulte di 4-5 giorni e trasferiscile in una gabbia separata. Ripetere per ottenere 6 gabbie se si esegue un test dose-risposta. Rimuovere la fonte di zucchero 1-24 ore prima del test di alimentazione.
- Preparare una soluzione madre di chimica come descritto sopra, tenendo conto della purezza della chimica (una soluzione madre tipica è 80 mM in acqua o tampone salino), e successivamente preparare diluizioni seriali in acqua/tampone secondo necessità.
- Aggiungere 40 μl di ciascuna delle diluizioni a 960 μl di sangue di coniglio defibrinato per ottenere la concentrazione di prova desiderata. Applicare il film di membrana su un'unità di alimentazione e sigillare con un anello di gomma. Trasferire 1 mL di sangue tramite pipetta e collegare l'unità di alimentazione a un'unità di riscaldamento.
- Tamponare delicatamente la superficie della membrana con una soluzione di acido lattico al 10% appena preparata e posizionare l'unità di alimentazione nella gabbia delle zanzare adulte. Copri la gabbia con un panno scuro o un sacco della spazzatura nero e lascia che le zanzare si nutrano per un'ora.
- Ripetere i passaggi 1.2 - 1.4 per il resto delle soluzioni di prova e il controllo negativo (solo sangue).
- Al termine della poppata, mettere i secchi a 4 °C in frigorifero per 5 minuti per anestetizzare le zanzare. Rimuovere le zanzare maschi e le zanzare femmine non nutrite e contare e registrare il numero totale di zanzare nutrite e parzialmente alimentate mediante l'esame dell'addome.
- Conservare le zanzare femmine parzialmente e completamente nutrite, puntando a un minimo di 50 zanzare alimentate con sangue per dose.
- Trasferire i secchi in una vasca di plastica o in una camera di crescita in condizioni costanti di 28 °C e 75 - 85% di umidità relativa (è preferibile un ciclo di 12 ore giorno/12 ore notte).
- Registrare il numero totale di zanzare morte/non responsibili a 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 e 72 ore (o punti temporali alternativi a seconda delle esigenze) utilizzando il foglio dei punteggi (Tabella 1).
- Il terzo giorno dopo l'alimentazione del sangue, introdurre un portauova nella gabbia e raccogliere le uova per un periodo di 72 ore. Contare il numero totale di ovuli prodotti per trattamento al microscopio da dissezione.
- Calcolare la percentuale di mortalità e fecondità in funzione del numero totale di zanzare alimentate per ciascun gruppo di trattamento e il controllo. Correggere la mortalità di controllo utilizzando la formula di Abbott modificata, se lo si desidera.
- Visualizzare i dati di tossicità e fecondità sotto forma di istogramma, grafico o curva esponenziale (se si esegue un test dose-risposta) utilizzando un software di propria scelta. Se si esegue un test dose-risposta, calcolare il valore di LD50, LD75 o LD90 per la chimica in esame relativa al controllo.
- Ripetere il test almeno due volte utilizzando lotti separati di zanzare per ottenere n = 3 o più repliche biologiche.
Tabella 1. Esempio di foglio di valutazione utilizzato per registrare i dati del test di alimentazione del sangue negli adulti.Le dosi tipiche utilizzate per testare sostanze chimiche antagoniste di piccole molecole come l'amitriptilina sono 50 μM, 100 μM, 200 μM e 400 μM.
| Mosquito Adult (3-5-day-old-old) Analisi topica |
| Data di inizio: |
| Investigatore: |
| Specie/Ceppo: |
| Tipo di test: Dose a punto singolo/dose-risposta |
| A. Mortalità (N. zanzare morte) |
| Tempo (ore) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | controllo |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| numero arabo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| B. Percentuale di mortalità |
| Tempo (ore) | Dose 1 | Dose 2 | Dose 3 | Dose 4 | Dose 5 | controllo |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| numero arabo | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |