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1. Produzione di lentivirus
NOTA: La produzione e la manipolazione di vettori lentivirali è stata effettuata secondo le linee guida del National Institutes of Health (NIH) per la ricerca che coinvolge il DNA ricombinante. Vengono utilizzati il plasmide che codifica per il mutante wild-type e A4V SOD1 marcato con YFP potenziato (SOD1WT-YFP e SOD1A4V-YFP). Entrambi i prodotti di fusione genica sono stati amplificati utilizzando la coppia di primer PCR 5'-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGC-3' e 5'-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3' e inseriti nel plasmide pTRIP-delta U3 CMV utilizzando i siti di restrizione XhoI e BsrGI. L'eliminazione di più di 20 passaggi e il mantenimento delle celle a una confluenza inferiore al 60% aiuta a garantire una buona efficienza di trasfezione.
- Il giorno 1, dividere le cellule HEK-293T al 30-40% di confluenza in una piastra di coltura tissutale di 10 cm di diametro (3 x 10⁶ cellule/piastra) in 10 mL di terreno di coltura cellulare (DMEM ad alto contenuto di glucosio con 10% FBS e 4 mM di L-glutammina) per la produzione del virus.
- Conservare la piastra per coltura tissutale di 10 cm di diametro in un incubatore a CO₂ (37 °C, 5% CO₂) per una notte.
- Il giorno 2, preparare una soluzione di trasfezione del DNA contenente 10 μg di vettori lentivirali (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP o -SOD1A4V-YFP) insieme ai plasmidi di imballaggio lentivirale (5 μg di pVSVg; 10 μg di pCMV-dR8.71) (Figura 1A). Aggiungere 125 μl di 1 M di CaCl₂ e regolare il volume a 500 μl utilizzando acqua distillata. Aggiungere delicatamente 500 μl di HEPES 0,05 M nella miscela e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Sostituire il terreno di coltura HEK-293T con 10 mL di terreno di coltura fresco preriscaldato privo di antibiotici, miscelato con 1 mL di soluzione di trasfezione di DNA e incubare per una notte a 37 °C, 5% di CO₂.
- Il giorno 3, sostituire il surnatante cellulare con un terreno di coltura fresco.
- Il giorno 4, raccogliere il surnatante in una provetta da 15 ml e centrifugare per 5 minuti a 500 x g per rimuovere le cellule morte e i detriti. Purificare ulteriormente il surnatante facendolo passare attraverso un filtro da 0,45 μm utilizzando una grande siringa da 60 ml. Erogare immediatamente in aliquote monouso (300 μl) e conservare a -80 °C. Per mantenere la massima attività del prodotto, evitare un ciclo di congelamento-scongelamento.
2. Trasduzione lentivirale
- Dividere la linea cellulare da infettare al 60% di confluenza (cellule HEK-293 e SH-SY5Y; 5 cellule da 10⁵ per pozzetto e U2OS; 1 da 10⁵ cellule per pozzetto) in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti in 2 mL di terreno DMEM integrato con FBS al 10%.
- Conservare la piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti in un incubatore a 37 °C al 5% di CO₂ per una notte.
- Togliere il lentivirus congelato dal congelatore a -80 °C e scongelarne un'aliquota con ghiaccio prima di ogni utilizzo; non ricongelare.
- Durante lo scongelamento del virus, riscaldare il terreno di coltura cellulare contenente il siero compatibile con la linea cellulare di interesse. Una volta che il virus è completamente scongelato, preparare una serie di diluizioni (1:3, 1:10, 1:30 e 1:100) in DMEM in una provetta microfuge fresca da 1,5 mL.
- Aumentare il volume nelle provette a 1 mL con terreni di sieroplastica ridotti.
- Aggiungere 2 μL di Polybrene (a una consistenza di 4 μg/μL) a 1 mL di virus/terreno. Mescolare bene pipettando e aggiungere 1 mL di miscela alle cellule. Incubare le cellule con il virus per 24 ore.
- Rimuovere il supporto antivirus e sostituirlo con un normale supporto DMEM integrato con il 10% di FBS. Mantenere le celle a 37 °C, 5% di CO₂.
- Monitorare la crescita delle cellule e cambiare i terreni di coltura ogni due giorni. Alla confluenza, espandere la piastra a 6 pozzetti in una piastra di coltura tissutale di 10 cm di diametro.
- Una volta che le cellule sono state sufficientemente espanse, seminare 1,5 x 10⁴ cellule per pozzetto in 50 μL di terreno DMEM su piastre di saggio a 384 pozzetti per verificare il livello di espressione della proteina marcata YFP mediante microscopia. Se l'espressione delle cellule proteiche marcate YFP mostra un rapporto segnale/rumore ≥3, preparare il materiale cellulare per la linea cellulare corrispondente.
3. Effetto dipendente dal tempo dell'inibitore del proteasoma sull'aggregazione proteica
NOTA: Esegui l'acquisizione delle immagini utilizzando un microscopio automatico (vedi Materiali).
- Erogare 0,25 μL di DMSO o inibitore del proteasoma disciolto in DMSO al 100% (ALLN, 2 mM) su piastre a fondo piatto da 384 pozzetti.
- Seminare manualmente 1,5 x 104 cellule per pozzetto in 50 μL di terreno DMEM sulla stessa piastra di analisi. La concentrazione finale dell'inibitore del proteasoma (ALLN) deve essere di 10 μM.
- Impostare l'unità di controllo ambientale del sistema di microscopio a 37 °C e 5% di CO₂. Uno screenshot della configurazione sperimentale è mostrato nella Figura 2.
- Utilizzare il microscopio in modalità fluorescenza ad ampio campo, utilizzando il software con le seguenti impostazioni: obiettivo LWD 20X, modalità non confocale, 4 campi/pozzetto, con un intervallo di acquisizione di un'ora. Al termine di ogni esecuzione, le immagini acquisite vengono caricate automaticamente sul server.
4. Imaging time lapse per l'espressione di YFP nelle cellule viventi e analisi delle immagini (canale singolo)
NOTA: I seguenti passaggi descrivono l'applicazione del software (ad esempio, Columbus).
- Selezionare l'algoritmo appropriato per segmentare gli oggetti primari (citosol e aggregati). Se necessario, regolare la soglia dello sfondo e i parametri di contrasto (Figura 3).
- Conta le celle utilizzando "trova celle" con una soglia individuale di 0,1 per il canale di intensità YFP. Determina gli aggregati utilizzando un algoritmo di "ricerca punti" con un'intensità dello spot YFP relativa >0,2 e un coefficiente di divisione di 1,0.
5. Effetto dose-risposta degli inibitori del proteasoma sull'aggregazione proteica su cellule viventi colorate per i loro nuclei (due canali)
NOTA: Esegui l'acquisizione di immagini utilizzando un microscopio automatizzato. Determinare l'intervallo di concentrazione degli inibitori del proteasoma (ALLN, Epoxomicina e MG132) in base al valore IC50 previsto per garantire un adattamento ottimale della curva.
- Preparare diluizioni seriali di composti su una piastra in polipropilene di stoccaggio a 384 pozzetti con la serie di diluizione standard 1:3. Assicurati di mescolare bene le diluizioni dei composti per assicurarti che le concentrazioni dei composti siano accurate.
- Erogare 0,25 μl di inibitori del proteasoma su piastre di saggio nere a 384 pozzetti vuote a fondo piatto. Utilizziamo un liquid handler dotato di una testa capillare a 384 in grado di trasferire volumi.
- Seminare 1,5 x 1010⁴ cellule per pozzetto in 50 μl di terreno DMEM su piastre di analisi. Incubare le piastre del saggio a 37 °C e 5% di CO₂ per 24 ore.
- Aggiungere 10 μL di terreno DMEM (preriscaldato a 37 °C) con soluzione colorante (Hoechst 33342 a una dose di 10 mg/mL) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Avviare il software operativo del microscopio. Una schermata della configurazione sperimentale è mostrata nella Figura 4. Seleziona la scheda "Configurazione" e seleziona l'obiettivo 20X e il tipo di piastra corretto. Assicurarsi che il "collare" sia impostato sul valore corretto sull'obiettivo, consentendo una messa a fuoco corretta con diversi tipi di targa.
- Selezionare la scheda "Microscopio". Definire l'esposizione 1 come YFP (laser 488) e l'esposizione 2 come Hoechst (laser 405). Attivare il filtro su entrambe le esposizioni e assegnare l'esposizione 1 alla fotocamera 1 e l'esposizione 2 alla fotocamera 2. Impostare i tempi di esposizione su ~800 ms per l'esposizione 1 e ~40 ms per l'esposizione 2.
- Selezionare l'esposizione 1. Impostare l'altezza di messa a fuoco su 0 μm. Selezionare "Messa a fuoco". Una volta messa a fuoco, esporre la fotocamera 1. Regola l'altezza di messa a fuoco per ottimizzare il piano di esposizione e fai clic su "Prendi altezza". Modificare i tempi di esposizione e la potenza del laser per ottenere un'intensità massima di pixel di ~3.000. Salva i parametri di esposizione. Ripetere per l'esposizione 2.
- Seleziona la scheda "Definizione esperimento". Crea un layout e un sottolayout. Trascina e rilascia il layout, l'esposizione, l'immagine di riferimento, il file di ritaglio inclinato e il sottolayout pertinenti. Salva l'esperimento.
- Seleziona la scheda "Esperimento automatico" e acquisisci le immagini. Al termine di ogni esecuzione, le immagini acquisite vengono caricate automaticamente sul server.
6. Analisi delle immagini di due canali
- Selezionare l'algoritmo software per segmentare gli oggetti primari (nuclei, citosol e aggregati) (Figura 5).
- Selezionare il metodo che segmenta accuratamente i nuclei mediante l'ispezione visiva degli oggetti segmentati. Gli oggetti colorati con Hoechst nel canale 1 (Ch1) saranno utilizzati per determinare il numero di cellule. La colorazione YFP del mutante SOD1-A4V nel canale 2 (Ch2) sarà utilizzata per determinare la quantità di aggregati.
- Conta le cellule utilizzando l'algoritmo "trova nuclei" come regioni di colorazione di Hoechst >20 μm², con un fattore di divisione di 7,0, una soglia individuale di 0,40 e un contrasto >0,10.
- Crea la tabella dei dati e determina EC50 per ciascuno dei composti utilizzando l'equazione di "regressione non lineare" nel software grafico.
