Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Saggio dell'attività delle endotossine (EAA)
- Raccogliere campioni di sangue del paziente in provette sterili contenenti anticoagulante EDTA. Conservare i campioni di sangue a temperatura ambiente
- Prepara le provette EA per il campione di sangue di ogni paziente che devi testare. Mettere le provette in rack per provette. Quindi rimuovere i tappi.
- Ogni test EA è composto da 5 diversi tipi di provette; utilizzarle per una parte diversa del test (fare riferimento ai passaggi successivi).
- Utilizzare la provetta #1 (la provetta "di controllo") per misurare l'attività basale del burst ossidativo aspecifico dei neutrofili del paziente in assenza di un anticorpo specifico.
- Utilizzare la provetta #2 (la provetta "campione") per misurare il burst ossidativo in risposta al complesso anticorpo lipopolisaccaride (LPS).
- Utilizzare la provetta #3 (la provetta "Max") per misurare il picco ossidativo massimo dei neutrofili del paziente in risposta a un eccesso di endotossina.
- Utilizzare la provetta #4 (la provetta "LPS") come fonte di endotossina esogena.
- Utilizzare la provetta #5 (provetta "Aliquota") per la conservazione del sangue.
NOTA: Vengono forniti duplicati delle provette #1, #2 e #3 per un totale di 8 provette da utilizzare per ogni campione di sangue da analizzare (il flacone di reagente EA e il test di controllo qualità possono essere utilizzati per tutti i test contenuti in una busta).
- Utilizzando una pipetta combinata, pipettare un volume di 1 mL di reagente EA dal flacone nelle provette #1 (provetta di controllo), #2 (provetta campione) e #3 (provetta Max), ciascuna in duplicato.
NOTA: Pipettare lungo il lato della provetta per evitare che la soluzione schizzi di nuovo.
- Mescolare il campione di sangue del paziente capovolgendo delicatamente la provetta per la raccolta del sangue 20 volte. Quindi, pipettare 0,5 mL di sangue del paziente nella provetta #4 (provetta LPS max) e nella provetta #5 (provetta Aliquot). Tubo a vortice #4 per 10 s.
- Inserire i rack per provette con tutte le provette EA nell'agitatore dell'incubatore. Chiudere il coperchio e incubare per 10 minuti alla temperatura di 37°C.
- Aprire il coperchio e rimuovere le griglie delle provette dall'agitatore dell'incubatrice. Tubo a vortice #5 (tubo aliquota). Utilizzando un puntale sterile, pipettare 40 μL di sangue nelle provette #1 e #2, in duplicato.
- Tubo Vortex #4 (tubo LPS). Utilizzando lo stesso puntale della pipetta, pipettare 40 μL di sangue dalla provetta #4 alla provetta #3 (provetta Max), in duplicato.
- Agitare le sei provette finali (#1, #2, #3 e rispettivi duplicati), quindi rimetterle nei loro rack.
NOTA: Assicurarsi che tutti i tubi siano vortici per lo stesso periodo di tempo.
- Rimettere i rack delle provette nell'agitatore di incubazione e chiudere il coperchio. Impostare l'agitatore di incubazione a 100 giri/min, quindi avviare il movimento per 14 minuti.
- Inserire la chip card con etichetta EA nel chemiluminometro e premere start. Dopo l'incubazione di 14 minuti, seguire le istruzioni visualizzate sul chemiluminometro per leggere le provette EA nell'ordine corretto.
- Agitare delicatamente ogni provetta per 10 s prima di posizionarla sul portacampioni del chemiluminometro. Aprire il cassetto del campione e posizionare la provetta #1 nel supporto del campione. Quindi, chiudere il cassetto del campione e attendere la lettura dell'unità di luce relativa (RLU).
- Ripetere il passaggio 1.12 per il tubo 2 e il tubo 3.
- Ripetere il passaggio 1.12 per i tubi duplicati 1, 2 e 3.
nota: Prova a far vorticare tutti i tubi per lo stesso periodo di tempo durante i passaggi 1.12-1.14.
- Dopo che tutte le provette sono state elaborate, si noti che i risultati EA verranno calcolati e stampati automaticamente. I livelli sono espressi come unità EA e rappresentano la media delle determinazioni duplicate dagli stessi campioni.
- Ripetere i passaggi da 1,4 a 1,15 per ogni campione di sangue che deve essere testato.
- Una volta completato il test, conservare le provette rimanenti e i reagenti EA a 2-8 °C per un massimo di 30 giorni.