Saggio del lisato di amebociti di limulus turbidimetrico: una tecnica per rilevare e quantificare la contaminazione da endotossine in farmaci nanoformulati

Abstract

Fonte: Neun, B. W. et al., Rilevamento di endotossine in nano-formulazioni utilizzando saggi di lisato di amebociti Limulus (LAL). J. Vis. Exp. (2019)

Questo video descrive il formato turbidimetrico del lisato di amoeciti Limulus, o LAL, per stimare la contaminazione da endotossine nelle nanoformulazioni di doxorubicina liposomiale PEGilata. La torbidità della soluzione a seguito della reazione dell'endotossina con il reagente LAL aiuta a stimare l'endotossina nel campione.

Protocollo

1. Preparazione di campioni di nanoparticelle

1. Preparare il campione di studio in acqua di grado LAL.
2. Se il pH del campione è al di fuori dell'intervallo 6-8, regolare il pH utilizzando idrossido di sodio apirogeno o acido cloridrico.
3. Utilizzando acqua di grado LAL, preparare diverse diluizioni del campione in studio. Assicurarsi che la diluizione massima non superi la diluizione massima valida (MVD).

2. Preparazione dei reagenti comuni tra i formati LAL

1. Diluire il brodo di idrossido di sodio concentrato utilizzando acqua reattiva LAL apirogena per preparare una soluzione di lavoro a una concentrazione di 0,1 N.
2. Diluire il brodo di acido cloridrico concentrato utilizzando acqua reattiva LAL apirogena e preparare una soluzione di lavoro alla concentrazione finale di 0,1 N.
3. Preparazione dello standard di controllo delle endotossine (CSE)
   1. Ricostituire il CSE secondo il certificato di analisi fornito dal produttore.
      nota: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli relativi al numero di catalogo e all'applicazione di una determinata formulazione di CSE in diversi formati LAL.
4. Preparazione del reagente LAL
   1. Ricostituire il reagente LAL secondo il certificato di analisi fornito dal produttore.
      nota: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli relativi al numero di catalogo e all'applicazione di una determinata formulazione di reagente LAL in diversi formati LAL.

3. Saggio LAL di torbidità

1. Preparazione degli standard di calibrazione
   1. Utilizzando 900 μl di acqua di grado LAL e 100 μl di CSE, preparare tutte le diluizioni intermedie necessarie per consentire la preparazione di uno standard di calibrazione con un intervallo di concentrazione da 0,001 a 1 EU/mL.
   2. Per prima cosa etichettare le provette e aggiungere 900 μl di acqua di grado CAL in ciascuna provetta. Quindi aggiungere 100 μL di soluzione 10 EU/mL per preparare lo standard di calibrazione con concentrazione di 1EU/mL.
   3. Ripetere la diluizione seriale di 10 volte come descritto sopra per preparare tre standard di calibrazione inferiori. Verificare che siano stati preparati quattro standard di calibrazione compresi tra 0,001 e 1 EU/mL.
2. Preparazione dei controlli di qualità
   1. Preparare un controllo di qualità 0,05 EU/mL combinando 50 μL della soluzione CSE 1 EU/mL con 950 μL di acqua LAL.
3. Preparazione dei controlli di inibizione/potenziamento (IEC)
   1. Preparare l'IEC con una concentrazione di 0,05 EU/mL combinando 25 μL della soluzione CSE 1 EU/mL e 475 μL del nanomateriale di prova a una data diluizione.
4. Procedura sperimentale
   1. Lasciare che lo strumento si riscaldi accendendolo con circa 30 minuti di anticipo. Impostare la lunghezza d'onda di rilevamento a 660 nm in quanto ciò è appropriato per la torbidità LAL.
   2. Accedi digitando il nome utente e la password.
   3. Aprire il software (Tabella dei materiali) facendo clic sull'icona corrispondente sullo schermo di un computer.
   4. Selezionare Raccogli dati nella schermata iniziale del software. Immettere l'ID del test e le informazioni sul gruppo di dati nello spazio corrispondente nella scheda Generale della schermata iniziale.
   5. Fare clic sulla scheda Hardware. Scegliere il tipo di strumento da un menu a discesa.
   6. Impostare la lunghezza d'onda di rilevamento a 660 nm in quanto appropriata per la torbidità LAL scegliendo il metodo di torbidità LAL.
   7. Verificare che sullo schermo vengano visualizzati il numero di serie, l'ID di sistema e le informazioni sulla porta seriale. Fare clic su OK. Fare clic su OK ancora una volta per confermare.
   8. Immettere l'ID del campione nello stesso ordine in cui viene eseguito il test. Utilizzare i pulsanti predefiniti per inserire il controllo negativo, la curva standard e i campioni di prova.
   9. Preparare provette duplicate per ogni campione e aggiungere 200 μl (rapporto di prova 4:1) o 100 μl (rapporto di prova 1:1) di controllo negativo (acqua), standard di calibrazione, controllo qualità, IEC e nanoparticelle di prova in provette di vetro pre-marcate.
   10. Aggiungere 50 μl (rapporto di prova 4:1) o 100 μl (rapporto di prova 1:1) di reagente LAL alla prima fiala di prova, agitarla brevemente e inserirla nella fessura di prova nel carosello dello strumento. Se si utilizza il rapporto 1:1, il volume del reagente LAL è di 100 μl.
   11. Ripetere la procedura sopra descritta per altri campioni. Elabora i campioni uno alla volta.
        

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
idrossido di sodio	sigma	Episodio 2770	Quando necessario, viene utilizzato per regolare il pH del campione in modo che sia compreso tra 6 e 8
acido cloridrico	sigma	H9892	Quando necessario, viene utilizzato per regolare il pH del campione in modo che sia compreso tra 6 e 8
Reagente LAL	Associati di Cape Cod	T0051	Questo reagente può essere utilizzato solo con il dosaggio della torbidità
Standard di controllo delle endotossine	Associati di Cape Cod	E0005	Questo reagente può essere utilizzato con saggi di torbidità e gel-clot
Acqua di grado LAL	Associati di Cape Cod	WP0501	Questo reagente può essere utilizzato con qualsiasi formato LAL
Glucashield Buffer	Associati di Cape Cod	GB051-25	Usato per prevenire la risposta falsa positiva dei beta-glucani
Provette monouso per diluizione in vetro prive di endotossine 12 x 75 mm	Associati di Cape Cod	TB240	Queste provette possono essere utilizzate con tutti e tre i saggi
Provette di reazione monouso in vetro prive di endotossine 8 x 75 mm	Associati di Cape Cod	TK100	Queste provette possono essere utilizzate con saggi di torbidità e cromogenici
Puntali apirogeni con volumi da 0,25 e 1,0 mL	RAININ	PPT25, PPT10	I puntali e le pipette possono adsorbire l'endotossina e rilasciare rilasciabili che interferiscono con il test LAL. Questi puntali RAININ sono utilizzati perché le loro prestazioni ottimali nel test LAL sono state verificate e confermate
Provette per microcentrifuga apirogene, 2,0 mL	Eppendorf	22600044	Possono essere utilizzate altre forniture equivalenti
Puntali combinati con tariffa di pirogeni, 5mL	Eppendorf	30089669	Possono essere utilizzate altre forniture equivalenti
Pipettatore ripetuto	Eppendorf	4982000020	Possono essere utilizzate altre forniture equivalenti
Microcetrifugo	qualsiasi marca		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Frigorifero, 2-8 C	qualsiasi marca		È possibile utilizzare qualsiasi marca
vortice	qualsiasi marca		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Congelatore, -20 C	qualsiasi marca		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Lettore Pyros Kinetix o Pyros Kinetix Flex	Associati di Cape Cod	PKF96	Possono essere utilizzati altri strumenti. Tuttavia, i reagenti LAL e gli standard di endotossine utilizzati in questo test possono richiedere un'ottimizzazione. Quando si utilizza altra strumentazione, fare riferimento ai produttori dello strumento e del kit LAL per le istruzioni