Saggio del lisato di amebociti Gel-Clot Limulus: un metodo per il rilevamento dell'endotossina batterica nelle formulazioni di nanoparticelle

Abstract

Fonte: Neun, B. W. et al., Rilevamento di endotossine in nano-formulazioni utilizzando saggi di lisato di amebociti Limulus (LAL). J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive un test gel-coagulo per determinare la presenza di endotossine batteriche in nano-formulazioni utilizzando Limulus Amoebocyte Lysate derivato dalle cellule del sangue dei granchi a ferro di cavallo. Il test aiuta a testare la contaminazione da endotossine dei prodotti farmaceutici, comprese le formulazioni a base di nanometria.

Protocollo

1. Preparazione di campioni di nanoparticelle

1. Preparare il campione di studio in acqua di grado LAL.
2. Se il pH del campione è al di fuori dell'intervallo 6-8, regolare il pH utilizzando idrossido di sodio apirogeno o acido cloridrico.
3. Utilizzando acqua di grado LAL, preparare diverse diluizioni del campione in studio. Assicurarsi che la diluizione massima non superi la diluizione massima valida (MVD).

2. Preparazione dei reagenti comuni tra i formati LAL

1. Diluire il brodo di idrossido di sodio concentrato utilizzando acqua reattiva LAL apirogena per preparare una soluzione di lavoro a una concentrazione di 0,1 N.
2. Diluire il brodo di acido cloridrico concentrato utilizzando acqua reattiva LAL apirogena e preparare una soluzione di lavoro alla concentrazione finale di 0,1 N.
3. Preparazione dello standard di controllo delle endotossine (CSE)
   1. Ricostituire il CSE secondo il certificato di analisi fornito dal produttore.
      nota: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli relativi al numero di catalogo e all'applicazione di una determinata formulazione di CSE in diversi formati LAL.
4. Preparazione del reagente LAL
   1. Ricostituire il reagente LAL secondo il certificato di analisi fornito dal produttore.
      nota: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli relativi al numero di catalogo e all'applicazione di una determinata formulazione di reagente LAL in diversi formati LAL.

3. Gel-Clot LAL

NOTA: Questo test identifica la presenza di endotossine nel campione in base all'osservazione visiva e al rilevamento di un coagulo nella provetta di reazione. Le fasi sperimentali sono descritte di seguito. Utilizzare un foglio di banco per registrare i risultati. Questo foglio da banco non è obbligatorio e sono accettabili anche altri modi per registrare i risultati del test. Un esempio di tale foglio da banco è fornito in materiali supplementari per comodità di un lettore. Lambda (l) è la sensibilità del test gel-clot ed è 0,03 EU/mL.

1. Etichettare tutte le provette di reazione necessarie per adattarsi al numero di campioni di prova analizzati. Fare riferimento alla scheda di banco per i dettagli sul numero di repliche utilizzate nella fase 1, nella fase 2 e nella fase 3 del test.
2. Aliquotare 100 μL di acqua, controlli o campione di prova per provetta.
3. Preparare il CSE in modo tale che la concentrazione finale sia pari a 4λ.
4. Combinare 100 μl dello standard sopra menzionato con 100 μl di acqua o campione di prova per ottenere la concentrazione finale di CSE di 2λ. Ripeti altre tre volte per ottenere lambda e mezza lambda e un quarto di lambda.
5. Assicurarsi che la temperatura nel bagnomaria sia di 37 °C.
6. Aggiungere 100 μl di lisato per provetta, agitare brevemente e posizionare il rack con tutte le provette nel bagnomaria per 1 ora.
7. Capovolgere il tubo con un movimento regolare.
8. Registrare manualmente i risultati utilizzando "+" (coagulo solido) o "-" (nessun coagulo o coagulo sciolto) sul foglio del banco.
9. Procedere con l'analisi secondo l'USP BET 85; utilizzare il foglio da banco come materiale di supporto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagente LAL	Associati di Cape Cod	G5003	Questo reagente è specifico per il test del coagulo di gel
Standard di controllo delle endotossine	Associati di Cape Cod	E0005	Questo reagente può essere utilizzato con saggi di torbidità e coaguli di gel
idrossido di sodio	sigma	Episodio 2770	Quando necessario, viene utilizzato per regolare il pH del campione in modo che sia compreso tra 6 e 8
acido cloridrico	sigma	H9892	Quando necessario, viene utilizzato per regolare il pH del campione in modo che sia compreso tra 6 e 8
Acqua di grado LAL	Associati di Cape Cod	WP0501	Questo reagente può essere utilizzato con qualsiasi formato LAL
Tampone Glucashield	Associati di Cape Cod	GB051-25	Usato per prevenire la risposta falsa positiva dei beta-glucani
Provette monouso per diluizione in vetro prive di endotossine 12 x 75 mm	Associati di Cape Cod	TB240	Queste provette possono essere utilizzate con tutti e tre i saggi
Provette di reazione in vetro monouso prive di endotossine 10 x 75 mm	Associati di Cape Cod	TS050	Queste provette sono destinate all'uso con il test gel-clot
Puntali apirogeni con volumi da 0,25 e 1 mL	RAININ	PPT25, PPT10	I puntali e le pipette possono adsorbire l'endotossina e rilasciare rilasciabili che interferiscono con il test LAL. Questi puntali RAININ sono utilizzati perché le loro prestazioni ottimali nel test LAL sono state verificate e confermate
Provette per microcentrifuga apirogene, 2,0 mL	Eppendorf	22600044	Possono essere utilizzate altre forniture equivalenti
Puntali combinati con tariffa di pirogeni, 5mL	Eppendorf	30089669	Possono essere utilizzate altre forniture equivalenti
Pipettatore ripetuto	Eppendorf	4982000020	Possono essere utilizzate altre forniture equivalenti
Microcetrifugo	Qualsiasi marca		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Frigorifero, 2-8° C	Qualsiasi marca		È possibile utilizzare qualsiasi marca
vortice	Qualsiasi marca		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Congelatore, -20 C	Qualsiasi marca		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Bagnomaria, 37° C	Qualsiasi marca		Qualsiasi marca può essere utilizzata, tuttavia, è importante spegnere la circolazione dell'acqua o utilizzare un bagnomaria non circolante perché il flusso d'acqua influenzerà la formazione di coaguli e porterà a risultati falsi negativi