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1. Attivazione della piastra del kit di analisi
- Attivare la piastra del kit del saggio con filtro a 96 pozzetti (contenente CPH-xilano blu) (elenco dei materiali) aggiungendo 200 μl di soluzione di attivazione (ottenuta con il kit) in ciascun pozzetto, seguita da un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione.
- Applicare il vuoto utilizzando un collettore per vuoto (con il blocco distanziatore all'interno e qualsiasi piastra standard trasparente a 96 pozzetti come piastra di raccolta) per rimuovere la soluzione di attivazione esistente. È anche possibile utilizzare una centrifuga a 2.700 x g per 10 minuti per questo passaggio al posto del collettore del vuoto.
- Lavare i substrati CPH aggiungendo 100 μl di acqua sterile e applicare un vuoto (o una forza centrifuga) per rimuovere lo stabilizzante. Ripeti questo passaggio altre due volte e le piastre sono ora pronte per l'uso.
2. Reazione enzimatica
NOTA: Includi sempre il tampone da solo come controllo negativo e, se possibile, enzimi precedentemente caratterizzati come controlli positivi. Utilizzare un numero statisticamente appropriato di repliche. I substrati CPH sono stabili tra pH 3,0 e 10,0 e il volume totale della soluzione enzimatica finale tampone in ciascun pozzetto non deve superare i 180 μl. Al posto della soluzione enzimatica purificata si possono utilizzare anche estratti vegetali o brodo di coltura.
- Aggiungere 150 μl di tampone acetato di sodio 100 mM, pH 4,5 e 5 μl di soluzione endocellulasica (fino a una concentrazione finale di 1 U/ml) in ciascun pozzetto della piastra del kit del saggio.
- Posizionare la piastra del prodotto (una piastra a pozzetti trasparenti compatibile con il lettore di micropiastre) sotto la piastra del kit di analisi per raccogliere eventuali perdite dalla piastra di reazione durante l'agitazione.
- Incubare la piastra del kit di saggio a 25 °C per 30 minuti in un agitatore orizzontale a 150 giri/min.
NOTA: La miscelazione della reazione nella piastra del kit del saggio durante l'incubazione è fondamentale per ottenere un risultato coerente e riproducibile. I substrati CPH sono stabili fino a 90 °C. Il tempo di incubazione deve essere aumentato fino a 24 ore quando si testano brodi di coltura contenenti concentrazioni enzimatiche sconosciute con substrati CPH. Si noti che i tempi di incubazione appropriati dipendono dall'attività dell'enzima o degli enzimi, ma in generale, se non c'è attività rilevabile entro 24 ore, è probabile che l'enzima non degradi il substrato testato. Un enzima attivo sta degradando i polisaccaridi cromogenici insolubili del substrato CPH in oligosaccaridi cromogenici solubili, che sono visibili come surnatanti colorati.
- Posizionare la piastra del prodotto pulito all'interno del collettore del vuoto con il blocco distanziatore all'interno.
- Posizionare la piastra del kit di analisi sulla parte superiore e applicare un vuoto (pressione negativa massima di -60 kPa). E' possibile utilizzare anche una centrifuga a 2.700 x g per 10 min.
NOTA: Il filtrato contenente gli oligosaccaridi colorati come prodotto di reazione è ora nella piastra del prodotto per ulteriori analisi.
3. Rilevamento e quantificazione
- Verificare che il volume di liquido in ciascun pozzetto della piastra del prodotto sia approssimativamente lo stesso mediante ispezione visiva.
- Leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 595 nm per il blu CPH-xilano utilizzando un lettore di piastre.
- Quando si esegue l'analisi dei dati, sottrarre i valori di controllo negativi del solo tampone dai valori dei pozzetti in cui è stato aggiunto un enzima. Calcolare il valore medio e l'errore standard delle medie (SEM) dai pozzi replicati.