1. Saggio cromogenico con substrati ICB in un formato a 96 pozzetti
- Reazione enzimatica
- Aggiungere 150 μl di tampone acetato di sodio 100 mM, pH 4,5 e 5 μl di soluzione di endo-xilanasi 31 U/ml a ciascun pozzetto della piastra del kit di saggio contenente paglia di grano rosso ICB (concentrazione enzimatica finale nel pozzetto: 1 U/ml).
nota: Le piastre del kit di analisi (piastre filtranti a 96 pozzetti contenenti substrati ICB) sono prodotte come descritto in letteratura (vedere l'elenco dei materiali). I substrati ICB sono stabili in tamponi con un intervallo di pH compreso tra pH 3,0 e 10,0. Includere sempre il tampone da solo come controllo negativo, gli enzimi commerciali come controllo positivo e utilizzare un numero statisticamente appropriato di repliche.
- Non attivare i substrati ICB come la piastra del substrato CPH, ma rimuovere lo stabilizzatore lavando tre volte con 100 μl di acqua seguita da filtrazione sottovuoto o centrifugazione.
- Posizionare la piastra del prodotto sotto la piastra del substrato per raccogliere eventuali perdite dalla piastra del substrato durante l'agitazione.
- Incubare la reazione a 25 °C agitando a 150 giri/min per 2 ore
nota: Un enzima attivo sta degradando i polisaccaridi cromogenici insolubili nel substrato ICB in oligosaccaridi solubili, visibili come surnatante colorato. I substrati ICB sono stabili fino a 90 °C. Il tempo di incubazione deve essere aumentato fino a 24 ore se si utilizzano enzimi non purificati come i brodi di coltura.
- Posizionare la piastra del prodotto all'interno del collettore del vuoto con il blocco distanziatore all'interno.
- Posizionare la piastra del kit di analisi sulla parte superiore e applicare il vuoto (pressione negativa massima di -60 kPa) o utilizzare una centrifuga per filtrare il prodotto dalla piastra del kit di analisi nel pozzetto della piastra del prodotto.
nota: Il filtrato contenente gli oligosaccaridi colorati come prodotto di reazione è ora nella piastra di raccolta per ulteriori analisi.
2. Rilevamento e quantificazione
- Verificare che il volume di liquido in ciascun pozzetto della piastra di raccolta sia approssimativamente lo stesso mediante ispezione visiva.
- Leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 517 nm per la paglia di grano rosso ICB utilizzando un lettore di piastre.
- Quando si esegue l'analisi dei dati, sottrarre il tampone, solo i valori di controllo negativi dai valori dei pozzetti in cui è stato aggiunto un enzima. Calcolare il valore medio e l'errore standard delle medie (SEM) dai pozzi replicati.
nota: In caso di screening di enzimi sconosciuti, si consiglia di effettuare una serie di diluizioni al fine di ottenere dati più dettagliati sull'intervallo dinamico dell'attività dell'enzima.
