1. Saggio di citotossicità: configurazione
- Preparare le soluzioni dei composti di interesse alle concentrazioni desiderate nei terreni appropriati (senza siero o FBS RPMI-1640 all'1, 2,5 o 5%).
- Per misurare la citotossicità di un singolo composto (ad esempio, per determinare dosi efficaci), preparare composti a una concentrazione finale 2x.
- Per misurare la citotossicità delle combinazioni di composti, preparare i composti a una concentrazione finale di 4x.
- Preparare i controlli con solo solvente mescolando la stessa quantità di solvente con il mezzo appropriato. Ad esempio, se si testano composti disciolti in DMSO e metanolo, effettuare un controllo solo solvente per ciascun solvente.
- Raccogliere le cellule dal piatto di coltura o dal matraccio in una provetta conica da 15 mL.
- Trasferire 10 μL di sospensione cellulare in una provetta per microcentrifuga e colorare con 10 μL di blu di tripano allo 0,4%. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule vitali e non vitali per ciascuna fonte cellulare.
- Pellet a 200 g per 5 min. Aspirare o decantare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in un terreno appropriato per il test (privo di siero o 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) a una densità cellulare di 3*105 cellule/mL.
NOTA 1: La densità cellulare di 3*105 cellule/mL fornisce una densità di semina di 15.000 cellule/pozzetto. La densità di semina è un parametro importante e idealmente dovrebbe essere pre-definita prima dell'esperimento. La densità di semina dovrebbe tenere in considerazione 1) la dimensione delle cellule: di solito le cellule più grandi vengono seminate a una densità inferiore; 2) durata del trattamento: le cellule vengono in genere seminate a una densità inferiore per esperimenti che dureranno più a lungo, e 3) tasso di divisione cellulare: le cellule con un tasso di divisione più elevato vengono seminate a una densità inferiore. Esempi specifici di densità di semina ottimizzate: cellule K562, più grandi, durata 24 ore – 10.000 cellule/pozzetto; Cellule MOLM-13, dimensioni moderate, trattamento 24 ore su 24 – 15.000/pozzetto; Celle MOLM-13, trattamento 48 ore – 8.000/pozzetto; piccole cellule mononucleate sane del sangue periferico (PBMC), trattamento 24 ore su 24 – 50.000/pozzetto; Cellule AML primarie, trattamento 24 ore su 24 – 15.000-20.000/pozzetto.
NOTA 2: La presenza di FBS nei terreni può influenzare l'attività dei composti. La riduzione della concentrazione di FBS può rendere i risultati dei test più semplici da interpretare, ma riduce anche l'accuratezza fisiologica.
- Seminare 50 μl di sospensione cellulare dalla fase 1.5 in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale.
- Aggiungere i composti come segue:
- Per i saggi di composti singoli, aggiungere 50 μl di soluzione composta 2x in ciascun pozzetto. Per i pozzetti di controllo del solvente, aggiungere 50 μl di terreno di prova contenente il solvente alla concentrazione 2x.
- Per i saggi combinati, aggiungere 25 μl di ciascuno dei composti (4 soluzioni) in ciascun pozzetto. Per i pozzetti di controllo a composto singolo, aggiungere 25 μl di soluzione composta 4x e 25 μl di terreno di prova. Per i pozzetti di controllo del solvente, aggiungere 50 μl di terreno di prova o di terreno di prova contenente il solvente.
NOTA 1: La concentrazione finale di DMSO non deve superare lo 0,5%.
NOTA 2: Si consiglia di aggiungere il terreno contenente i composti con la pipetta che tocca la parete di ciascun pozzetto a causa del basso volume.
- Picchiettare delicatamente la piastra per garantire la miscelazione del contenuto dei pozzetti.
- Incubare le piastre a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 per un tempo adeguato, ad esempio 24 ore.
2. Saggio di citotossicità: colorazione con Hoechst 33342 e ioduro di propidio
- Preparare 10 volte la soluzione colorante. Questa soluzione deve essere preparata fresca prima di ogni esperimento, non può essere conservata. Le concentrazioni finali del colorante devono essere determinate prima dell'esperimento.
- Per le linee cellulari leucemiche e le cellule leucemiche primarie, 1 mL di tampone di colorazione 10x contiene 10 μL di Hoechst 33342 20 mM e 50 μL di ioduro di propidio 1 mg/mL in PBS sterile (concentrazioni finali: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL).
- Per PBMC sani, 1 mL di tampone di colorazione 10x contiene 10 μL di Hoechst 33342 20 mM e 10 μL di ioduro di propidio 1 mg/mL in PBS sterile (concentrazioni finali: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL).
nota: La concentrazione finale di ioduro di propidio deve essere determinata prima degli esperimenti. Le cellule devono essere testate utilizzando un intervallo di concentrazioni di PI (1, 2,5, 5 μg/mL), quindi la vitalità calcolata da Hoechst/PI deve essere confrontata con la vitalità misurata tramite il blu di tripano. Le concentrazioni di PI sopra elencate sono state scelte in base alla vitalità delle cellule bersaglio nei pozzetti di controllo dei terreni (superiore a ~90% per le linee cellulari leucemiche, superiore a ~70% per le PBMC sane).
cautela: Hoechst 33342 e lo ioduro di propidio sono potenziali agenti cancerogeni. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati durante la manipolazione.
- Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 10 μl di tampone di colorazione 10x a ciascun pozzetto.
nota: Per evitare la contaminazione incrociata, assicurarsi che i puntali delle pipette non tocchino il fluido.
- Picchiettare delicatamente il piatto per mescolare ed eliminare le bolle. Colorare a 37 °C per 15 min.
- Centrifugare la piastra a 200 g per 4 minuti per portare tutte le celle sul fondo della piastra. Pulire accuratamente il fondo della lastra con un panno umido per rimuovere fibre e/o detriti che interferiranno con l'imaging.
NOTA 1: La centrifugazione della piastra garantisce le massime possibilità di catturare tutte le cellule nell'immagine. Spesso le cellule morte si staccano e galleggiano, fornendo valori fuorvianti di citotossicità. La centrifugazione mitiga questo effetto.
NOTA 2: La piastra deve essere visualizzata il più rapidamente possibile dopo la centrifugazione, idealmente entro 15 minuti. La centrifugazione può ridurre la selettività della colorazione PI e può consentire alle cellule di accumulare lentamente ioduro di propidio. Il miglioramento dell'accuratezza ottenuto visualizzando le cellule morte supera il leggero aumento della colorazione PI
