Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Isolamento degli eritrociti dal sangue intero
- Aggiungere 500 μL di sangue intero in destrosio acido citrato (ACD) (conservato a 4 °C) in una provetta da microcentrifuga.
nota: Il sangue intero veniva acquistato in ACD. Secondo l'azienda, 1,5 ml di ACD vengono aggiunti a 7 ml di sangue intero (8,5 ml di volume totale).
- Centrifugare il sangue intero a 700 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e rimuovere il plasma chiaro e il sottile buffy coat utilizzando una pipetta per lasciare lo strato di eritrociti rossi.
- Preparare 1 L di soluzione Ringer contenente 125 mM di NaCl, 5 mM di KCl, 1 mM di MgSO4, 32 mM di HEPES, 5 mM di glucosio e 1 mM di CaCl2. Regolare il pH a 7,4 aggiungendo 2 μl di gocce di NaOH 1,0 M. Per preparare una soluzione Ringer priva di glucosio, seguire lo stesso protocollo, ma non includere il glucosio nella soluzione.
- Lavare gli eritrociti 2 volte in soluzione di Ringer sospendendo il pellet cellulare in 1,5 mL di soluzione di Ringer, centrifugando a 700 x g per 5 minuti a RT e rimuovendo il surnatante.
- Effettuare un ematocrito allo 0,4% risospendendo 40 μL del pellet eritrocitario in 9.960 μL di soluzione di Ringer priva di glucosio per raggiungere un volume finale di 10 mL.
nota: L'ematocrito è un termine usato per riferirsi alla frazione di volume degli eritrociti in sospensione. Un ematocrito allo 0,4% è una sospensione contenente lo 0,4% di eritrociti.
- Incubare la sospensione cellulare a 37 °C per 7 giorni.
2. Trattamento degli eritrociti con ionomicina e misurazione dell'emolisi
- Sciogliere 1 mg di sale di calcio ionomicina in 630 μL di dimetilsolfossido (DMSO) per raggiungere una concentrazione finale di 2 mM. Aliquotare e conservare a -20 °C.
- Prelevare 1 mL di ematocrito allo 0,4% del passaggio 1.5 e aggiungere 0,5 μL di ionomicina 2 mM per raggiungere una concentrazione finale di 1 μM. Incubare per 2 ore a 37 °C.
- Utilizzare 1 mL di ematocrito senza trattamento con ionomicina come controllo negativo.
- Centrifugare gli ematocriti trattati con ionomicina e non trattati a 700 x g per 5 minuti a RT e rimuovere i loro surnatanti per lasciare i pellet cellulari sul fondo delle provette.
- Lavare le cellule 3 volte con la soluzione di Ringer sospendendo i pellet cellulari in 1,5 mL di soluzione di Ringer, centrifugando a 700 x g per 5 minuti a RT e scartando i surnatanti.
- Per misurare l'emolisi, aggiungere 1 mL di ematocrito allo 0,4% non trattato dalla fase 1,5 a una provetta da microcentrifuga e incubare per 2 ore a 37 °C come controllo negativo per l'emolisi (0%).
- Aggiungere 1 mL di ematocrito allo 0,4% non trattato dalla fase 1,5 a una provetta da microcentrifuga e centrifugare a 700 x g per 5 minuti a RT. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di acqua distillata al pellet cellulare e incubare per 2 ore a 37 °C come controllo positivo per l'emolisi (100%).
- Aggiungere 1 mL di ematocrito allo 0,4% trattato con ionomicina dal passaggio 2.2 a una provetta da microcentrifuga.
- Centrifugare le cellule non trattate, le cellule trattate e le cellule in acqua distillata a 700 x g per 5 minuti a RT.
- Prelevare 200 μl di surnatanti e aggiungerli a una piastra a 96 pozzetti.
- Misurare l'assorbanza a 541 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
- Calcola l'emolisi usando l'equazione 1:
%Emolisi = (AT - A0)/(A100 - A0)*100
dove A0 è l'assorbanza degli eritrociti nella soluzione di Ringer, A100 è l'assorbanza degli eritrociti in acqua e AT è l'assorbanza degli eritrociti trattati mediante ionomicina.
