Saggio di legame dell'annessina V: una tecnica basata sulla fluorescenza per identificare gli eritrociti apoptotici tramite marcatura della fosfatidilserina

Abstract

Fonte: Bigdelou, P., et al. Induzione dell'eriptosi nei globuli rossi utilizzando uno ionoforo di calcio. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo il test di legame dell'annessina V per misurare il grado di eriptosi, la morte cellulare programmata degli eritrociti, utilizzando la colorazione fluorescente con annessina V. Gli eritrociti apoptotici dimostrano la traslocazione della fosfatidilserina dal lembo interno a quello esterno della membrana cellulare, facendo sì che l'annessina V marcata con fluoroforo si leghi alla fosfatidilserina traslocata, emettendo così un segnale fluorescente.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Saggio di legame dell'annessina-V

1. Sciogliere 1 mg di sale di calcio ionomicina in 630 μL di dimetilsolfossido (DMSO) per raggiungere una concentrazione finale di 2 mM. Aliquotare e conservare a -20 °C.
2. Prelevare 1 mL di ematocrito allo 0,4% e aggiungere 0,5 μL di ionomicina 2 mM per raggiungere una concentrazione finale di 1 μM. Incubare per 2 ore a 37 °C.
3. Centrifugare gli ematocriti trattati con ionomicina e non trattati a 700 x g per 5 minuti a RT e rimuovere i loro surnatanti per lasciare i pellet cellulari sul fondo delle provette.
4. Lavare le cellule 3 volte con la soluzione di Ringer sospendendo i pellet cellulari in 1,5 mL di soluzione di Ringer, centrifugando a 700 x g per 5 minuti a RT e scartando i surnatanti.
5. Risospendere i pellet di cellule eritrocitarie trattate con ionomicina e non trattate in 1 mL di tampone legante 1x.
6. Diluire 2 mL del tampone legante 5x annestina V in 8 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ottenere 1x tampone legante.
7. Prelevare 235 μl di sospensioni cellulari nel tampone di legame e aggiungere 15 μl di annessina V-Alexa Flour 488 coniugato.
8. Incubare le cellule a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti in un luogo buio. Centrifugare a 700 x g per 5 minuti a RT e rimuovere il surnatante.
9. Lavare le cellule 2 volte con 1 tampone legante, sospendendo il pellet cellulare in 1,5 ml di tampone legante, centrifugando a 700 x g per 5 minuti a RT e rimuovendo il surnatante.
10. Risospendere i pellet cellulari in 250 μl di tampone legante 1x per le misure di citometria a flusso.

2. Citometria a flusso

1. Trasferire 200 μl di eritrociti colorati con annessina V in provette di polistirene a fondo tondo da 1 mL compatibili con la citometria a flusso.
2. Accedi al software di citometria a flusso e fai clic sul pulsante Nuovo esperimento. Fare clic sul pulsante del nuovo tubo. Seleziona il foglio globale e scegli l'analisi applicata per misurare l'intensità della fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm.
3. Impostare il numero di cellule su 20.000 da raccogliere per l'analisi di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS).
4. Selezionare il tubo desiderato e fare clic sul pulsante di caricamento. Fare clic sul pulsante di registrazione per le misurazioni della dispersione diretta e laterale. Ripetere l'operazione per tutti i campioni.
5. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul campione e fare clic su applica analisi batch per generare il file dei risultati.
6. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul campione e fare clic su genera file FSC.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Annexin V Alexa Fluor 488 - kit per l'apoptosi	Fisher Scientifico	Codice: A10788	Conservare a 4 °C
Citometro a flusso BD FACSAria II	BD Bioscienze	643177
Sale di calcio ionomicina	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Sciogliere in DMSO per raggiungere 2 mM. Conservare a -20 °C
centrifuga	Millipore Sigma	Codice: M7157	Modello Eppendorf 5415C
Provetta per citometria a fondo tondo monouso	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	Fisher Scientifico	C79-500
DPBS	VWR Scienze della vita	SH30028.02
Provetta per microcentrifuga	Fisher Scientifico	02-681-5
Sangue intero nell'ACD	Zen-Bio		Conservare a 4 °C e scaldare a 37 °C prima dell'uso