Saggio di legame dell'annessina V: una tecnica basata sulla fluorescenza per identificare gli eritrociti apoptotici tramite marcatura della fosfatidilserina

Abstract

Fonte: Bigdelou, P., et al. Induzione dell'eriptosi nei globuli rossi utilizzando uno ionoforo di calcio. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo il test di legame dell'annessina V per misurare il grado di eriptosi, la morte cellulare programmata degli eritrociti, utilizzando la colorazione fluorescente con annessina V. Gli eritrociti apoptotici dimostrano la traslocazione della fosfatidilserina dal lembo interno a quello esterno della membrana cellulare, facendo sì che l'annessina V marcata con fluoroforo si leghi alla fosfatidilserina traslocata, emettendo così un segnale fluorescente.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Saggio di legame dell'annessina-V

1. Sciogliere 1 mg di sale di calcio ionomicina in 630 μL di dimetilsolfossido (DMSO) per raggiungere una concentrazione finale di 2 mM. Aliquotare e conservare a -20 °C.
2. Prelevare 1 mL di ematocrito allo 0,4% e aggiungere 0,5 μL di ionomicina 2 mM per raggiungere una concentrazione finale di 1 μM. Incubare per 2 ore a 37 °C.
3. Centrifugar....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V Alexa Fluor 488 - kit per l'apoptosi	Fisher Scientifico	Codice: A10788	Conservare a 4 °C
Citometro a flusso BD FACSAria II	BD Bioscienze	643177
Sale di calcio ionomicina	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Sciogliere in DMSO per raggiungere 2 mM. Conservare a -20 °C
centrifuga	Millipore Sigma	Codice: M7157	Modello Eppendorf 5415C
Provetta per citometria a fondo tondo monouso	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	Fisher Scientifico	C79-500
DPBS	VWR Scienze della vita	SH30028.02
Provetta per microcentrifuga	Fisher Scientifico	02-681-5
Sangue intero nell'ACD	Zen-Bio		Conservare a 4 °C e scaldare a 37 °C prima dell'uso