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NOTA: Come comodo punto di riferimento per i lettori, la seguente metodologia descrive le condizioni di coltura specifiche e i materiali necessari per la misurazione della biodisponibilità del Fe da 20 campioni sperimentali, oltre ai controlli di qualità richiesti, in una serie del biotest. Si sconsiglia di aumentare il numero di campioni oltre questa capacità a causa del tempo necessario per le varie fasi di coltura cellulare e digestione in vitro all'interno del biotest.
1. Scegliere la quantità di campioni
- Per gli alimenti solidi o liquidi, determinare una quantità di cibo che possa essere considerata rappresentativa del campione da testare.
- Nel test della biodisponibilità del Fe da una varietà di fagiolo, utilizzare 100-150 g di semi di fagiolo e trasformare questa quantità in un campione omogeneo.
- Per campioni liquidi come succhi fortificati, prodotti lattiero-caseari e bevande sportive, assicurarsi che il cibo sia ben miscelato prima del campionamento.
NOTA: La quantità di materiale di semi di fagioli sopra menzionata è essenziale per tenere conto delle differenze intrinseche tra i semi di questa coltura di base.
2. Preparazione dei campioni
- Sciacquare il terreno e la polvere da qualsiasi campione di cibo con acqua distillata-deionizzata prima della lavorazione.
- Elaborare la quantità appropriata di campione secondo gli obiettivi sperimentali, ad esempio con il metodo di cottura e la macinazione.
NOTA: Per la cottura e la lavorazione, è fondamentale utilizzare pentole e attrezzature che non siano una potenziale fonte di contaminante Fe. Le apparecchiature in acciaio inossidabile non contaminano; tuttavia, attrezzature come macine per mulini a pietra, pentole in ghisa e qualsiasi apparecchiatura non in acciaio inossidabile contenente Fe possono aggiungere quantità significative di contaminante Fe. Un macinacaffè standard in acciaio inossidabile è spesso adeguato per la macinatura.
- Liofilizzare e macinare fino a ottenere una polvere omogenea.
NOTA: Una volta omogeneizzati, la ricerca ha dimostrato che tre repliche indipendenti dell'analisi sono adeguate per ogni alimento misurato.
- Se l'omogeneità del campione è difficile da ottenere, rivedere la formulazione o la lavorazione del prodotto. Se ciò non è possibile, aggiungere repliche se la non omogeneità non è grave.
- Per la maggior parte degli alimenti solidi omogenei, utilizzare 0,5 g di campione liofilizzato per replica. Se necessario, utilizzare fino a 1,0 g di campione per replica, ma verificare se più di 0,5 g producono un beneficio nel grado di risposta.
NOTA: Quantità superiori a 0,5 g di alimenti solidi possono ostruire la membrana della dialisi (vedi sotto).
- Utilizzare 1-2 mL di campioni liquidi.
nota: La liofilizzazione spesso non è necessaria per i campioni liquidi.
3. Coltura cellulare Caco-2
- Colture stock
- Acquistate le cellule di Caco-2 da un fornitore certificato.
- Coltura delle cellule da fiale di riserva a 37 °C in un incubatore con un'atmosfera d'aria al 5% di CO2 (umidità costante) utilizzando il Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con 25 mM di HEPES (pH 7,2), siero fetale bovino (FBS) al 10% (v/v) e soluzione antibiotico-antimicotica all'1%.
- Una volta che un numero sufficiente di cellule è disponibile, di solito dopo 7-10 giorni di coltura, seminare le cellule in fiasche non rivestite di collagene a una densità di 30.000 cellule/cm2.
- Scegliere la dimensione del pallone in base al numero di celle disponibili e necessarie per la semina di piastre multipozzetto.
NOTA: In generale, i palloni T225 (225 cm2) funzionano meglio per gli esperimenti in cui vengono utilizzate 11 piastre multipozzetto (6 pozzetti; 9,66 cm2/pozzetto) (10 piastre per il confronto dei campioni, 1 piastra per i controlli di qualità) per biotest.
- Far crescere le cellule in fiasche per 7 giorni, cambiando il terreno a giorni alterni, e utilizzarle il 7° giorno per la semina delle piastre multipozzetto.
NOTA: Si consiglia di utilizzare un intervallo di passaggio non superiore a 10-15 passaggi da quando le cellule vengono avviate dalla coltura madre e successivamente utilizzate in una serie di esperimenti. I passaggi delle colture cellulari dovrebbero essere limitati in quanto un'ampia gamma di passaggi può comportare cambiamenti adattativi nella linea cellulare e, quindi, variabilità nella risposta del modello.
- Coltura cellulare su piastre multipozzetto
- Seminare le cellule di Caco-2 a una densità di 50.000 cellule/cm2 in piastre rivestite di collagene a 6 pozzetti.
NOTA: Questo passaggio di solito funziona meglio se fatto di mercoledì. I seguenti passaggi renderanno evidente il motivo per cui questo giorno della settimana è ottimale.
- Far crescere le cellule per 12 giorni a 37 °C in un incubatore con un'atmosfera d'aria di CO2 al 5% (umidità costante) utilizzando DMEM integrato con 25 mM di HEPES (pH 7,2), FBS al 10% (v/v) e >NOTA: La coltura dei monostrati cellulari per più di 12 giorni può provocare una crescita eccessiva delle cellule. Ricerche precedenti hanno chiaramente dimostrato che, in queste condizioni, a 12 giorni dalla semina, il monostrato cellulare è maturo, ben attaccato alla piastra e ottimale nella consistenza della risposta. La crescita delle cellule più a lungo, ad esempio fino a 19-21 giorni, provoca una crescita eccessiva delle cellule e il terreno si esaurisce rapidamente in sostanze nutritive, con conseguente formazione di monostrati malsani.
- Durante il periodo di 12 giorni, cambiare il mezzo almeno ogni 2 giorni secondo un programma giornaliero coerente.
- Il 12° giorno dopo la semina, sostituire il terreno di coltura con 2 mL di Minimum Essential Medium (MEM [pH 7]) integrati con 10 mM di PIPES (piperazina-N,N'-bis-[acido 2-etansolfonico]), soluzione antibiotica-antimicotica all'1%, idrocortisone (4 mg/L), insulina (5 mg/L), selenio (5 μg/L), triiodotironina (34 μg/L) e fattore di crescita epidermico (20 μg/L).
NOTA: Se la semina è iniziata di mercoledì, il 12° giorno sarebbe un lunedì.
- Il giorno successivo (cioè il giorno 13), rimuovere il MEM e sostituirlo con 1 ml di MEM (pH 7).
NOTA: Questo passaggio si verificherebbe di martedì. Questo è il giorno in cui inizia il biotest; Pertanto, il programma di 13 giorni offre il vantaggio di un programma settimanale coerente, che consente di condurre il biotest in modo coerente nello stesso giorno della settimana.
4. Digestione in vitro
- Preparazione degli anelli di inserimento
- Creare un anello di inserimento sterilizzato utilizzando un O-ring in silicone dotato di una membrana per dialisi lavata con acido (Figura 1A).
NOTA: Preparare i foglietti illustrativi con 1 giorno di anticipo (ad es. lunedì, giorno 12) del giorno del biotest e conservare in acqua a 18 MΩ a 4 °C fino al momento dell'uso.
- Il giorno del biotest (martedì 13), rimuovere gli inserti dal frigorifero, scolare e sostituire l'acqua con 0,5 M HCl. Lasciarlo a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare per almeno 1 ora prima dell'uso.
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito prima di rimuovere il MEM dalle piastre di coltura. Il lavaggio acido della membrana serve a rimuovere eventuali contaminanti di Fe e sterilizza l'anello di inserimento e la membrana.
- Scolare l'HCl 0,5 M dagli inserti e risciacquare con acqua sterile a 18 MΩ. Conservare in acqua sterile da 18 MΩ a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare fino al momento dell'uso.
- Inserire un anello in ciascun pozzetto delle piastre a 6 pozzetti con celle Caco-2, creando così un sistema a due camere. Rimettere le piastre con gli inserti nell'incubatrice.
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito subito dopo l'aggiunta di 1,0 ml di MEM freschi a ciascun pozzetto (vedere il passaggio 3.2.5.).
- Preparazione della soluzione di pepsina
- Il giorno dell'esperimento, preparare la soluzione di pepsina sciogliendo 0,145 g di pepsina in 50 ml di 0,1 M HCl. Agitare delicatamente la soluzione su un agitatore a piattaforma per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Preparazione della soluzione pancreatina-bile
- Lo stesso giorno dell'esperimento, preparare 0,1 M di NaHCO3 sciogliendo 2,1 g di NaHCO3 in 250 mL di acqua a 18 MΩ.
- Mescolare 0,35 g di pancreatina e 2,1 g di estratto biliare in 175 mL di 0,1 M NaHCO3.
- Una volta solubilizzati la pancreatina e l'estratto biliare, aggiungere 87,5 g di resina a scambio cationico debole (vedere la Tabella dei materiali) e mescolare agitando per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Versare l'impasto in una grande colonna e raccogliere l'eluato.
- Eluire la colonna con altri 70 mL di 0,1 M di NaHCO3, raccogliendo questo volume nella soluzione biliare di pancreatina.
NOTA: Lo scopo della resina è quello di rimuovere il contaminante Fe che si trova comunemente negli estratti di pancreatina-bile.
- Avviare la digestione in vitro.
- Pesare il campione in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL (polipropilene), quindi aggiungere 10 mL di soluzione fisiologica a pH 2, contenente 140 mM di NaCl e 5 mM di KCl.
- Avviare il processo di digestione gastrica aggiungendo 0,5 mL della soluzione preparata di pepsina suina al campione e incubare su un agitatore a dondolo a bassa temperatura per 1 ora a 37 °C.
- Trascorso questo periodo, avviare il processo di digestione intestinale di ciascun campione regolando il pH a 5,5-6,0 con 1,0 M NaHCO3.
- Aggiungere 2,5 mL di soluzione pancreatina-bile a ciascuna provetta del campione e regolare il pH a 6,9-7,0 con 1,0 M di NaHCO3.
- Una volta regolato il pH, equalizzare il volume in ciascuna provetta utilizzando una soluzione di 140 mM di NaCl, 5 mM di KCl (pH 6,7), misurando il peso della provetta con un valore target di 15 g.
NOTA: Per alcuni alimenti, potrebbe essere necessario portare il volume totale a 16 g o 17 g, a seconda della capacità tampone degli alimenti.
- Trasferire 1,5 mL di ciascun digestato intestinale nella camera superiore (cioè contenente l'anello di inserimento con la membrana di dialisi) di un pozzetto corrispondente della piastra di coltura a 6 pozzetti contenente le cellule Caco-2 (Figura 1B).
- Riposizionare il coperchio della piastra e incubare a 37 °C (atmosfera d'aria di CO2 al 5%) su un agitatore a dondolo a 6 oscillazioni/min per 2 ore.
- Rimuovere l'anello di inserimento con il digestato e aggiungere un ulteriore 1 mL di MEM (pH 7) a ciascun pozzetto.
- Rimettere la piastra di coltura cellulare nell'incubatore (37 °C; 5% di CO2 nell'aria atmosferica) per altre 22 ore.
- Dopo 22 ore, rimuovere il terreno di coltura cellulare e aggiungere 2,0 mL di acqua a 18 MΩ al monostrato cellulare.
NOTA: L'acqua liserà osmoticamente le cellule.
- Raccogliere l'intero lisato cellulare in provette standard per microcentrifuga in polipropilene o simili per le successive analisi delle proteine cellulari e della ferritina cellulare.
