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NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza di classe II con il soffiatore acceso e le luci spente.
1. Preparazione dei materiali
NOTA: Tutti i materiali sono elencati nella Tabella dei Materiali.
- Preparare il terreno 1, il terreno di centrifugazione 2 e le soluzioni di conservazione e di lavoro di 2-deossi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-il) ammino]-D-glucosio (2-NBDG o FD-glucosio) secondo la Tabella 1 in una cappa di biosicurezza di Classe II. Proteggi il glucosio FD dalla luce durante l'esperimento spegnendo tutte le luci sotto il cofano.
- Utilizzare reagenti per colture cellulari pronti all'uso: tripsina-EDTA, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e Dulbecco's Modified Eagle Medium (di seguito, DMEM senza glucosio) e senza rosso fenolo.
- Utilizzare 20 mL di tampone per lisi con test di radioimmunoprecipitazione (RIPA).
NOTA: Nelle sezioni seguenti, la deplezione extracellulare e l'assorbimento intracellulare di diverse dosi di FD-glucosio sono confrontati nei fibroblasti 3T3-L1 con e senza stimolazione insulinica (Figura 1).
2. Coltura cellulare 3T3-L1 e mantenimento
- Coltura di fibroblasti di topo 3T3-L1 mediante piastratura di 1 x 106 cellule diluite in 20 mL di Medium 1 in due piastre da 96 pozzetti. Piastra 100 μL di sospensione cellulare per pozzetto, assicurando di mantenere l'omogeneità di questa sospensione mediante miscelazione. Coltivare le cellule per 48 ore in un incubatore a 37 °C (5% CO2 e 95% di umidità) senza cambiare terreno fino a circa il 70%-80% di confluenza.
- Mantenere le cellule confluenti e a digiuno coltivandole nello stesso terreno per 48 ore. Variare il tempo di incubazione da 24 a 72 ore a seconda dello stato catabolico di digiuno desiderato.
3. Fame di cellule 3T3-L1
- Decantare i terreni dalle celle nelle piastre a 96 pozzetti. Assorbire il liquido rimanente utilizzando salviette di carta sterili.
- Sciacquare la piastra a 96 pozzetti con 100 μl di PBS per pozzetto e assorbire il liquido rimanente con carta assorbente sterile.
- Aggiungere 100 μl di DMEM privo di glucosio per pozzetto e incubare per 40 minuti. Regolare il tempo di incubazione in base al tipo di cellula, agli stimoli e al livello di digiuno desiderato.
NOTA: Il tempo di incubazione può richiedere un'ottimizzazione a seconda della stagione.
4. Preparazione di soluzioni di FD-glucosio con diverse concentrazioni
NOTA: L'esperimento nella Figura 1 esamina i mezzi extracellulari e intercellulari con e senza stimolazione con insulina.
- Utilizzare otto repliche (una fila in una piastra a 96 pozzetti) per ogni condizione di stimolazione. Pertanto, preparare 1 ml per ciascuna condizione di stimolazione (specificata nella Tabella 2 e seguenti).
- Utilizzare otto condizioni di stimolazione senza insulina: FD-glucosio di 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL e 0 μg/mL (controllo senza FD-glucosio) in una piastra a 96 pozzetti.
- Utilizzare otto condizioni di stimolazione con insulina (10 μg/mL, concentrazione finale): FD-glucosio di 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL e 0 μg/mL (controllo senza FD-glucosio) in un'altra piastra a 96 pozzetti.
- Per preparare le condizioni di stimolazione, diluire 1 μL di soluzione di lavoro FD-glucosio da 5 mg/mL (Tabella 1) in 999 μL di DMEM privo di glucosio per ottenere 1 mL di soluzione madre di lavoro (diluizione 1:1000 o 5 μg/mL).
- Utilizzando questa soluzione madre, preparare diluizioni 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 e 1:100.000 di FD-glucosio per ottenere 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,05 μg/mL (Tabella 2) in provette da 2 mL immediatamente prima degli esperimenti in una cabina di biosicurezza senza luci.
- Ripetere il passaggio 4.4 e aggiungere 1 μL di insulina (10 mg/mL, concentrazione finale) a ciascuna delle condizioni sopra specificate.
NOTA: La concentrazione finale di insulina in questi campioni è 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Per ottenere l'omogeneizzazione, aggiungere insulina ai tubi prima di aggiungere altre soluzioni.
5. Trattamento delle cellule 3T3-L1 affamate
- Dopo 40 minuti di incubazione, decantare il DMEM privo di glucosio da ciascun pozzetto in piastre da 96 pozzetti e assorbire il liquido rimanente con carta assorbente sterile.
- Aggiungere 100 μl (per pozzetto) ciascuno dalle varie condizioni di trattamento sopra descritte ai pozzetti lungo una colonna e 100 μl (per pozzetto) dalla stessa condizione di trattamento ai pozzetti lungo la fila (otto repliche) in entrambe le piastre da 96 pozzetti. Etichettare le piastre che hanno utilizzato le condizioni con e senza insulina. Aggiungere il solo DMEM privo di glucosio ai pozzetti di controllo (n = 8).
- Incubare la piastra per 40 minuti in un incubatore per colture cellulari (37 °C, 5% CO2 e 95% di umidità) al buio.
6. Misurazioni extracellulari e intercellulari per cellule 3T3-L1 stimolate
- Dopo che le cellule sono state stimolate per 40 minuti, trasferire il terreno di stimolazione da entrambe le piastre in nuove piastre a 96 pozzetti mantenendo lo stesso layout sperimentale.
- Decantare l'eventuale soluzione rimanente dalle piastre originali stimolate a 96 pozzetti con cellule su salviette di carta sterili.
- Opzionalmente, lavare le celle con PBS. Rimuovere il PBS e decantare la soluzione rimanente su salviette di carta sterili.
- Aggiungere 100 μl del tampone di lisi RIPA a ciascun pozzetto. Facoltativamente, aggiungere l'inibitore della proteasi al tampone RIPA per proteggere le proteine. Mettere le piastre contenenti RIPA in uno shaker per 30 minuti.
- Utilizzando un lettore di micropiastre (Tabella dei materiali), misurare la fluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione (Ex) ed emissione (Em) rispettivamente di 485 e 535 nm, prima nel terreno contenente FD-glucosio extracellulare e poi nella piastra con cellule LIZZATE RIPA al termine di 30 minuti di incubazione (vedere il passaggio 6.4).
Tabella 1: Preparazione di terreni di coltura e soluzioni di glucosio FD.
| Soluzione/Terreno | Componenti |
| Etanolo:DMSO (1:1/v/v) | Etanolo (200 μL) e DMSO (200 μL) in provette da 1-1,5 mL; utilizzare etanolo per colture cellulari e DMSO |
| Medio 1 | DMEM (89 mL), penicillina/streptomicina (1%) (1 mL) e siero di vitello (10%) (10 mL) in provetta sterile da 50 mL |
| Terreno di centrifugazione 2 | DMEM (89 mL), penicillina/streptomicina (1%) (1 mL) e siero bovino (10%) (10 mL) in provetta sterile da 50 mL |
| Conservazione FD-soluzione di glucosio 5 mg/mL (14,5 mM) | Glucosio FD (1 mg) ed etanolo:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) in provetta da 0,5 mL; conservare a -80 °C, preferibilmente in atmosfera di argon o azoto |
| Soluzione FD-glucosio funzionante 5 μg/mL (14,5 mM) | Conservazione FD soluzione di glucosio 5 mg/mL (1 μL), DMEM senza glucosio (999 μL); preparare immediatamente prima dell'esperimento. |
Tabella 2: Preparazione di soluzioni di FD-glucosio con diverse concentrazioni per gli esperimenti mostrati nella Figura 1.
| diluizione | controllo | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2,5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Concentrazione (μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0,5 | 0,2 | 0,1 | 0,05 |
| DMEM senza glucosio (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glucosio 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
