Misurazione della deplezione dell'analogo del glucosio fluorescente extracellulare: una tecnica di misurazione surrogata per valutare l'assorbimento del glucosio negli organi di topo ex vivo

In questo articolo

Abstract

Fonte: Kumar, S. B. et al., Deplezione extracellulare del glucosio come misura indiretta dell'assorbimento del glucosio in cellule e tessuti ex vivo.J. Vis. Exp.(2022)

In questo video, dimostriamo una tecnica ex vivo per misurare la deplezione dell'analogo del glucosio extracellulare negli organi di topo prelevati. Consiste nell'incubare il tessuto di topo in una soluzione contenente deossiglucosio marcato in fluorescenza, che viene assorbito dalle cellule. L'assorbimento dell'analogo del glucosio può essere determinato indirettamente misurando la fluorescenza del terreno incubato.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza di classe II con il soffiatore acceso e le luci spente.

1. Preparazione dei materiali

NOTA: Tutti i materiali sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Preparare il terreno 1, il terreno di centrifugazione 2 e le soluzioni di conservazione e di lavoro di 2-deossi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-il) ammino]-D-glucosio (2-NBDG o FD-glucosio) secondo la Tabella 1 in una cappa di biosicurezza di Classe II. Proteggi il glucosio FD dalla luce durante l'esperimento spegnendo tutte le luci sotto il cofano.
Utilizzare reagenti per colture cellulari pronti all'uso: tripsina-EDTA, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e Dulbecco's Modified Eagle Medium (di seguito, DMEM senza glucosio) e senza rosso fenolo.

2. Misurazione ex vivo della deplezione extracellulare di FD-glucosio negli organi

Pretrattare i topi con composti che stimolano il metabolismo del glucosio prima della dissezione dell'organo, come segue.
Usa topi maschi Lep^ob di nove settimane (n = 11). Nutrire tutti i topi con una dieta a base di cibo regolare prima dell'esperimento.
Assegnare i topi in modo casuale in tre gruppi per le iniezioni intraperitoneali (i.p.).
1. Iniettare nei topi del gruppo Lep^ob di controllo 0,1 mL di PBS sterile (n = 4).
2. Iniettare nei topi del gruppo insulina Lep^ob 0,1 mL di PBS sterile, contenente 12 UI di insulina umana per grammo di peso corporeo (BW) (n= 3).
3. Iniettare nei topi del gruppo AAC2 Lep^ob 0,1 mL di PBS sterile, contenente 0,1 nmol di AAC2 per grammo di peso corporeo (BW) (n = 4).
Dopo 15 minuti, sottoporre i topi all'inalazione di isoflurano al 5% ed essanguare il sangue mediante puntura cardiaca dagli animali anestetizzati.
Sezionare il tessuto adiposo bianco epididimale viscerale (200 mg), il fegato (200 mg) e l'intero cervello da ciascun animale. Utilizzare una cappa di biosicurezza di Classe II per la manipolazione dei tessuti.
Preparare la soluzione di lavoro FD-glucosio (0,29 mM) in DMEM privo di glucosio in una cabina di Biosicurezza di Classe II senza luce.
Misurare la fluorescenza della soluzione di lavoro FD-glucosio (0,29 mM) a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 485 e 535 nm, utilizzando un lettore di micropiastre.
Incubare i tessuti/organi prelevati in una piastra a 6 pozzetti contenente PBS per 1 minuto. Maneggiare ogni tessuto o organo in un pozzetto separato.
Dopo 1 minuto, posizionare ogni fazzoletto su un tovagliolo di carta sterile per assorbire la PBS. Trasferire i tessuti/organi in una piastra separata a 6 pozzetti contenente 4.000 μl di DMEM privo di glucosio e incubare per 2 minuti.
Dopo 2 minuti, rimuovere e trasferire i tessuti nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti contenente 0,29 mM di soluzione di lavoro FD-glucosio (1 mL/pozzetto). Incubare le piastre a 6 pozzetti contenenti tessuti in soluzione di lavoro FD-glucosio a 37 °C (5% CO₂ e 95% di umidità).
Raccogliere 100 μL di soluzione di lavoro FD-glucosio da ciascun pozzetto dopo 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minuti di incubazione, per analizzare la cinetica della deplezione extracellulare del glucosio FD. Agitare prima e dopo la raccolta.
Trasferire 100 μL di soluzione di lavoro FD-glucosio in piastre a 96 pozzetti per misurare la fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 485 e 535 nm, utilizzando un lettore di micropiastre.
Normalizzare la fluorescenza al valore 0 min (100%) per ciascun organo in ciascun animale (Figura 1).

Tabella 1: Preparazione di terreni di coltura e soluzioni di glucosio FD.

Soluzione/Terreno	Componenti
Etanolo:DMSO (1:1/v/v)	Etanolo (200 μL) e DMSO (200 μL) in provette da 1-1,5 mL; utilizzare etanolo per colture cellulari e DMSO
Medio 1	DMEM (89 mL), penicillina/streptomicina (1%) (1 mL) e siero di vitello (10%) (10 mL) in provetta sterile da 50 mL
Terreno di centrifugazione 2	DMEM (89 mL), penicillina/streptomicina (1%) (1 mL) e siero bovino (10%) (10 mL) in provetta sterile da 50 mL
Conservazione FD-soluzione di glucosio 5 mg/mL (14,5 mM)	Glucosio FD (1 mg) ed etanolo:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) in provetta da 0,5 mL; conservare a -80 °C, preferibilmente in atmosfera di argon o azoto
Soluzione FD-glucosio funzionante 5 μg/mL (14,5 mM)	Conservazione FD soluzione di glucosio 5 mg/mL (1 μL), DMEM senza glucosio (999 μL); preparare immediatamente prima dell'esperimento.

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Risultati

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Figura 1: Cinetica della deplezione extracellulare di FD-glucosio in diversi organi ex vivo. (A-C) Ai ^topi lepob sono stati iniettati veicolo (PBS, n = 4), insulina (12 UI/kg di peso corporeo, n = 3) e AAC2 (1 nmol/g di peso corporeo, n = 3). Dopo 15 minuti, i tessuti sono stati sezionati e isolati. Gli espianti di (A) grasso viscerale, (...