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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale
1. Misurazione della contrazione (esempio SMC)
- Preparare un array ECIS 96w10e (vedere la Figura 1A per un'immagine rappresentativa dell'array con elettrodi ingranditi e celle seminate sugli elettrodi).
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi sotto una cappa a flusso laminare per colture tissutali sterili.
- Rivestire un array sterile 96w10e con 200 μL di 10 mM di L-cisteina per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare la piastra due volte con acqua sterile. Lasciare asciugare la piastra per una notte nella cappa di coltura tissutale con il coperchio leggermente aperto.
NOTA: Il rivestimento della piastra con L-cisteina è necessario solo quando si utilizza la piastra per la prima volta.
- Il giorno successivo, sterilizzare con i raggi UV la piastra e il coperchio per 30 minuti. Ruotare il coperchio verso l'alto in modo che l'interno sia sterilizzato. Una volta sterilizzata la piastra, non aprirla al di fuori della cappa di flusso.
- Semina delle celle sull'array ECIS
- Preriscaldare la soluzione di gelatina sterile all'1% a bagnomaria per 30 min.
NOTA: La soluzione è conservata in frigorifero e potrebbe solidificarsi, rendendo difficile la pipettazione.
- Successivamente, rivestire i pozzetti con 100 μl della soluzione di gelatina all'1 % per pozzetto e incubare la piastra a 37 °C per almeno 1 ora.
- Aspirare la gelatina dai pozzetti.
- Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato e seminare le SMC in triplicato a una densità di semina di 30.000 cellule/pozzetto in 200 μL di terreno SMC.
- Posizionare la piastra con le SMC nel supporto ECIS a 96 pozzetti dell'incubatore per colture cellulari. Fare doppio clic sul software ECIS Applied Biophysics per aprire il programma e premere il pulsante Setup.
- Controllare se tutti gli elettrodi sono a contatto con il supporto (verde; rosso se non c'è connessione) nel pannello inferiore sinistro etichettato Configurazione pozzetti. Se gli elettrodi non sono collegati correttamente, regolare la piastra nel supporto prima di iniziare la misurazione.
- Selezionare il tipo di piastra (array a 96 pozzetti) nello stesso pannello facendo clic su Tipo di array.
- Nel pannello in alto a destra Impostazione raccolta dati, fare clic su una singola frequenza e modificare il valore di impedenza a 4000 Hz e l'intervallo a 8 s.
- Fare clic sul pulsante Avvia per avviare le misurazioni. Attendi l'apertura di un nuovo pannello, in cui è possibile salvare il file ECIS.
- Lasciare che le celle si attacchino e stabiliscano un monostrato per 48 h.
NOTA: L'attacco e la diffusione delle celle sugli elettrodi generano un valore di resistenza di base (Figura 1B).
- Stimolazione delle cellule per indurre la contrazione
- Indurre la contrazione delle SMC stimolando le cellule con 10 μg/mL di ionoforo di calcio, ionomicina.
NOTA: La ionomicina indurrà l'afflusso di Ca2+ extracellulare, attivando la cascata contrattile; vedere la Figura 2A per immagini rappresentative di cellule contratte non stimolate e stimolate.
- Diluire 1 mg di polvere di ionomicina in 100 μl di dimetilsolfossido per ottenere una soluzione madre di 10 mg/mL e conservare 10 μl di aliquote a -20 °C. Prima dell'uso, diluire la soluzione di ionomicina 1:10 nel terreno SMC per preparare la soluzione di lavoro da aggiungere alle cellule.
- Eseguire la stimolazione cellulare mentre l'array è ancora nel supporto dell'array all'interno dell'incubatore per colture cellulari e gli elettrodi sono collegati al sistema.
- Per stimolare le cellule, rimuovere il coperchio e posizionarlo su una superficie sterile all'interno dell'incubatrice. Preparare due pipette, impostate a 2 μl e 150 μl.
- Prima di iniziare la stimolazione, premere Contrassegna nel software e inserire un commento.
NOTA: In questo modo sarà più facile trovare il momento esatto della stimolazione durante l'analisi dei dati.
- Pipettare 2 μL della soluzione di lavoro della iocomicina in ciascun pozzetto il più rapidamente possibile. Una volta che tutte le cellule sono state stimolate, mescolare il terreno nei pozzetti utilizzando la seconda pipetta.
NOTA: A causa degli effetti rapidi, non è necessario cambiare le punte tra diverse linee cellulari e condizioni. Lavora rapidamente stimolando e mescolando perché la ionomicina ha un effetto acuto. Quando si stimola una piastra piena, stimolare un massimo di 3 colonne contemporaneamente. Dopo ogni stimolazione, attendere almeno 30 minuti fino alla stimolazione successiva per consentire alle cellule di riprendersi dalla temperatura e dalla variazione di CO2 causata dall'apertura della porta dell'incubatrice.
- Subito dopo aver eseguito la stimolazione, premere nuovamente Contrassegna per aggiungere un commento che la stimolazione è terminata.
- Terminare l'esperimento di stimolazione
- Registrare i valori di impedenza per circa 5 minuti dopo la stimolazione con ionomicina. Terminare la registrazione premendo Fine.
