Il saggio del filamento di actina scorrevole: un test di motilità in vitro per studiare la traslocazione dei filamenti di actina su miosine immobilizzate

Abstract

Fonte: Tripathi, A., et al. Adattamenti specifici della miosina dei saggi di motilità basati sulla microscopia a fluorescenza in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

In questo video, eseguiamo un test di motilità in vitro per analizzare le interazioni actina-miosina. Il movimento di scorrimento dei filamenti di actina sulle molecole di miosina immobilizzate viene visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Protocollo

1. Saggio del filamento di actina scorrevole

1. Preparazione vetrino coprioggetti
   1. Preparare una soluzione di nitrocellulosa all'1% in acetato di amile.
   2. Procurarsi una piastra per coltura tissutale (150 x 25 mm) e aggiungere una carta da filtro circolare (diametro 125 mm) sul fondo della piastra.
   3. Caricare otto vetrini coprioggetti quadrati n. 1,5 di spessore 22 mm su una griglia e lavare con circa 2-5 ml di etanolo a prova 200 seguiti da 2-5 ml di acqua distillata (dH₂O). Ripetere questa fase di lavaggio, terminando con l'acqua. Quindi, asciugare completamente i vetrini coprioggetti utilizzando una linea di aria filtrata o una linea N₂.
   4. Prelevare un vetrino coprioggetti e pipettare lentamente 10 μl della soluzione di nitrocellulosa all'1% lungo un bordo del vetrino. Quindi, con un movimento fluido, spalmarlo sul resto del vetrino coprioggetti utilizzando il lato di un puntale per pipetta da 200 μl a lato liscio. Posizionare questo vetrino coprioggetti sulla piastra di coltura tissutale con il lato di nitrocellulosa rivolto verso l'alto. Ripetere l'operazione per i vetrini coprioggetti rimanenti e lasciarli asciugare mentre si preparano i reagenti rimanenti, quindi utilizzare i vetrini coprioggetti entro 24 ore dal rivestimento.
2. Preparazione della camera
   1. Pulisci un vetrino da microscopio con una carta per lenti ottiche per rimuovere i detriti di grandi dimensioni. Tagliare due pezzi di nastro biadesivo di circa 2 cm di lunghezza.
   2. Posizionare un pezzo lungo il centro del bordo lungo del vetrino del microscopio. Assicurarsi che il bordo del nastro sia allineato con il bordo della diapositiva. Posiziona il secondo pezzo di nastro a circa 2 mm sotto il primo pezzo di nastro in modo che i due siano paralleli e allineati. In questo modo si crea una camera di flusso in grado di contenere circa 10 μL di soluzione (vedere la Figura 1).
   3. Prendi uno dei vetrini coprioggetti rivestiti di nitrocellulosa della Parte 1. Incollare con cura il vetrino coprioggetti sul nastro in modo che il lato rivestito di nitrocellulosa entri in contatto diretto con il nastro (vedere la Figura 1). Utilizzando la punta di una pipetta, premere delicatamente sull'interfaccia del nastro scorrevole per assicurarsi che il vetrino coprioggetti abbia aderito correttamente al vetrino. Taglia il nastro in eccesso che pende dal bordo del vetrino con una lama di rasoio.
3. Preparazione dell'actina
   1. Produrre 20 μM di F-actina polimerizzando l'actina globulare (G-actina) nel tampone di polimerizzazione (50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0) a 4 °C durante la notte.
   2. Diluire la F-actina a 5 μM in tampone di motilità (20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Etichettare con un eccesso molare di almeno 1,2 volte superiore a quello di rodamina-falloidina. Lasciare (coperto con un foglio di alluminio) per almeno 2 h sul ghiaccio. Questo può essere utilizzato per un massimo di 1-2 mesi e conservato in ghiaccio.
4. Esecuzione del saggio del filamento di actina planante miosina 5a
   NOTA: In questa sezione vengono forniti i dettagli del test di scivolamento della miosina 5a (HMM).
   1. Preparare le soluzioni per la miosina 5a descritte nella Tabella 1 e tenerle in ghiaccio.
   2. Fluire in 10 μL di miosina 5a (50-100 nM) attraverso la camera di flusso e attendere 1 minuto.
   3. Flusso in 10 μL di 1 mg/mL di BSA in 50 mM MB con 1 mM DTT (tampone "a basso contenuto di sale"). Ripetere questo lavaggio altre due volte e attendere 1 minuto dopo il terzo lavaggio. Utilizzare l'angolo di un fazzoletto di carta o di carta da filtro per far passare la soluzione attraverso il canale posizionando delicatamente l'angolo della carta all'uscita della camera di flusso.
   4. Lavare con 10 μl di 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripetere questo lavaggio altre due volte.
   5. Flusso in 10 μL della soluzione di actina nera (5 μM di F-actina, 1 μM di calmodulina e 1 mM di ATP in 50 mM MB con 1 mM di DTT) per eliminare le "teste morte".
      1. Pipettare la soluzione con una siringa da 1 ml e un ago da 27 G per tagliare i filamenti di actina prima di introdurre la soluzione nella camera. Ripeti questo passaggio altre due volte e attendi 1 minuto dopo la terza volta. Sono sufficienti circa 20 eventi di pipettaggio.
      2. Per eseguire la rotazione "dead head", aggiungere una quantità stechiometrica di F-actina alla miosina in presenza di 1 mM di ATP e 1 mM di MgCl₂ a una concentrazione salina di 500 mM. Quindi ultracentrifugare a 480.000 x g per 15 minuti a 4 °C. La miosina morta sarà nel pellet.
   6. Flusso in 50 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT e 1 mM ATP per esaurire la camera dei filamenti di actina liberi.
   7. Lavare con 10 μl di 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripeti questo lavaggio altre due volte per esaurire la camera di ATP.
   8. Fluire in 10 μL di soluzione di rodamina actina (Rh-Actina) da 20 nM contenente 1 mM di DTT in 50 mM MB e attendere 1 minuto per consentire il legame rigoroso dei filamenti di actina alla miosina 5a attaccata alla superficie del vetrino coprioggetti.
   9. Lavare con 10 μl di 50 mM MB con 1 mM DTT per lavare via i filamenti di Rh-actina non legati alla superficie. Ripetere questo lavaggio altre due volte.
   10. Flusso in 30 μl di tampone finale.
   11. Registra immagini su un microscopio a fluorescenza utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 561 nm per visualizzare la Rh-actina. Un tempo di esposizione appropriato è di 200 ms con una potenza laser di 1,4 mW per una durata totale di acquisizione di 0,5-1 min.
       NOTA: Assicurarsi che la velocità di acquisizione sia scalata in modo appropriato in base alla velocità dei filamenti in movimento. Una considerazione importante prima di raccogliere dati da utilizzare con i programmi di tracciamento è la frequenza dei fotogrammi di acquisizione. I movimenti dei subpixel tra i fotogrammi risulteranno in una sovrastima della velocità e sono necessari movimenti di diverse centinaia di nanometri per ottenere valori accurati. Una velocità di acquisizione ottimale è caratterizzata dallo scorrimento dell'actina per una distanza di almeno un pixel tra i fotogrammi. Nel caso del microscopio TIRF utilizzato per l'imaging qui, questa soglia si traduce in 130 nm; Pertanto, una miosina che si prevede viaggi di 1 μm/s deve essere ripresa a una velocità di 5 fotogrammi/s (intervallo di 0,2 s) per ottenere 200 nm di movimento, mentre una miosina che si prevede viaggi a 10 nm/s richiede 0,05 fotogrammi/s (intervalli di 20 s). I dati possono quindi essere sottocampionati in questa fase, se necessario.

Tabella 1: Tamponi utilizzati nel saggio di planata

Nome buffer	Composizione (M5a)	Composizione (NM2b)	Passo/i utilizzato/i (M5a/NM2b)	Commenti
4X Buffer di motilità (4X MB)	80 mM MOPS, pH 7,2	80 mM MOPS, pH 7,2		Filtro sottovuoto e conserva a 4°C
	20 mM di MgCl2	20 mM di MgCl2
	0,4 mM EGTA	0,4 mM EGTA
	pH 7,4	pH 7,4
50 mM Tampone di motilità salina (50 mM MB)	25% v/v 4X MB	25% v/v 4X MB		Filtra sottovuoto e conserva a 4°C
	50 mM KCl	50 mM di NaCl
	Alza al volume con dH2O	Alza al volume con dH2O
500 mM Tampone di motilità salina (500 mM MB)	N/A	25% v/v 4X MB		Filtra sottovuoto e conserva a 4°C
		500 mM di NaCl
		Alza al volume con dH2O
Miosina	0,05-0,1 μM di miosina	0,2 μM di miosina	4.2	Mantieni il ghiaccio.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Diluire in 50 mM MB	Diluire in 500 mM MB
1 mg/mL Albumina sierica bovina (BSA)	1 mg/mL di BSA	1 mg/mL di BSA	4.3	Mantieni il ghiaccio.
	Diluire in 50 mM MB	Diluire in 500 mM MB
	1 mM DTT	1 mM DTT
5 μM F-actina non marcata in 50 mM MB (actina nera)	5 μM di F-actina non marcata	5 μM di F-actina non marcata	4.5	Mantieni il ghiaccio. Tagliare l'actina pipettando su e giù 5-10 volte o utilizzando una siringa.
	1 μM di calmodulina (CaM)	1 mM ATP
	1 mM ATP	0,2 mM di CaCl2
	Diluire in 50 mM MB	1 μM CaM
		1-10 nM miosina catena leggera chinasi (MLCK)
		Diluire in 50 mM MB
MB con 1 mM DTT e 1 mM ATP	1 mM DTT	1 mM DTT	4.6	Mantieni il ghiaccio.
	1 mM ATP	1 mM ATP
	Diluire in 50 mM MB	Diluire in 50 mM MB
MB con DTT	1 mM DTT	1 mM DTT	4.4, 4.7, 4.9	Mantieni il ghiaccio.
	Diluire in 50 mM MB	Diluire in 50 mM MB
20 nM Rodamina-Falloidina F-actina (Rh-Actina)	20 nM Rodammina-falloidina F-actina	20 nM Rodammina-falloidina F-actina	4.8	Mantieni il ghiaccio. Non vortice.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Diluire in 50 mM MB	Diluire in 50 mM MB
Buffer finale	50 mM KCl	0,7% di metilcellulosa (opzionale)	4.10	Aggiungi il glucosio, la glucosio ossidasi e la catalasi immediatamente prima di eseguire l'esperimento. Mantenere il ghiaccio.
	20 mM MOPS, pH 7,2	50 mM di NaCl
	5 mM di MgCl2	20 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA	5 mM di MgCl2
	1 mM ATP	0,1 mM EGTA
	50 mM DTT	1 mM ATP
	1 μM di calmodulina	50 mM DTT
	2,5 mg/mL di glucosio	1–10 nM MLCK
	100 μg/mL di glucosio ossidasi	0,2 mM di CaCl2
	40 μg/mL di catalasi	1 μM di calmodulina
		2,5 mg/mL di glucosio
		100 μg/mL di glucosio ossidasi
		40 μg/mL di catalasi

Risultati

Figura 1: Preparazione di camere a celle di flusso funzionalizzate. (A) Iniziare con un vetrino da microscopio pulito, due pezzi di nastro biadesivo tagliati a circa 2 cm e un vetrino coprioggetti funzionalizzato. (B) Aggiungere il nastro al centro del vetrino del microscopio. (C) Fissare il vetrino coprioggetti al nastro con il rivestimento (cioè ni...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetato di amile	Industrie di ricerca Ladd	Codice 10825
ATP	Millipore Sigma	Codice: A7699
Albumina sierica bovina	Millipore Sigma	Codice: 5470
Calmodulina		PMID: 2985564
catalasi	Millipore Sigma	C40
Carta da filtro circolare - Saggio di scorrimento	Millipore Sigma	WHA1001125
Portavetrini coprioggetti	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Vetrini: Saggio del filamento ad azione scorrevole	VWR Internazionale	Codice 48366-227
DL-ditiotreitolo	Millipore Sigma	D0632
Nastro biadesivo	Deposito uffici	909955
EGTA	Millipore Sigma	E4378
etanolo	Fischer Scientific	Visualizzazione del materiale A4094
G-actina		PMID: 4254541	La G-actina può essere conservata a 200 μM in N2 liquido.
glucosio	Millipore Sigma	G8270
Glucosio ossidasi	Millipore Sigma	G2133
Kcl	Fischer Scientific	P217-500
Punte di pipette a grande orifizio	Fischer Scientific	02-707-134
Metilcellulosa	Millipore Sigma	Codice: M0512
Vetrini per microscopio	Fischer Scientific	12-553-10
Mops	Fischer Scientific	BP308-100
nitrocellulosa	Industrie di ricerca Ladd	Codice: 10800
Lamette	Deposito uffici	397492
Rodamina-Falloidina	ThermoFisher Scientifico	R415	Il materiale madre può essere diluito in metanolo al 100% fino a una concentrazione finale di 200 μM.
Piatto di coltura tissutale - Saggio di scorrimento	Corning	353025	Ogni piatto di coltura tissutale può contenere circa nove vetrini.
Puntali per pipette da 200 μl con lati lisci	Thomas Scientific	Codice 1158U38
attrezzatura
centrifuga	ThermoFisher Scientifico	75006590
microscopio	Nikon	Modello: Eclipse Ti con sistema H-TIRF con obiettivo TIRF 100x (N.A. 1.49)
Fotocamera per microscopio	Andor	Modello: fotocamera EMCCD iXon DU888 (formato sensore 1024 x 1024)
Scatola di controllo ambientale per microscopio	Tokai HIT	Thermobox personalizzato
Unità laser per microscopio	Nikon	LU-n4 quattro unità laser con laser a stato solido per 405 nm, 488 nm, 561 nm e 640 nm
Ultracentrifuga da tavolo Optima Max-Xp	Beckman Coulter	393315