Saggio di motilità invertita: una tecnica in vitro per visualizzare il movimento della miosina su filamenti di actina immobilizzati

Abstract

Fonte: Tripathi, A., et al. Adattamenti specifici della miosina dei saggi di motilità basati sulla microscopia a fluorescenza in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

In questo video, eseguiamo un test di motilità in vitro per analizzare le interazioni actina-miosina. Il movimento di scorrimento dei filamenti di actina sulle molecole di miosina immobilizzate viene visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Protocollo

1. Purificazione delle proteine

1. Lisi cellulare ed estrazione di proteine
   1. Preparare un buffer di estrazione 1,5x in base alla Tabella 1. Filtrare e conservare a 4 °C.
   2. Inizia a scongelare i pellet di celle con ghiaccio. Durante lo scongelamento dei pellet, integrare 100 ml di tampone di estrazione con 1,2 mM di ditiotreitolo (DTT), 5 μg/mL di leupeptina, 0,5 μM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) e due compresse di inibitori della proteasi. Mantenere il ghiaccio.
   3. Una volta scongelato il pellet, aggiungere 1 mL del tampone di estrazione integrato per 10 mL di coltura cellulare. Ad esempio, se i pellet cellulari sono stati formati da 500 mL di coltura cellulare, aggiungere 50 mL di tampone di estrazione integrato al pellet.
   4. Sonicare i pellet cellulari mantenendoli in ghiaccio. Per ogni pellet utilizzare le seguenti condizioni: 5 s ON, 5 s OFF, durata 5 min, potenza 4-5.
   5. Raccogliere tutto il lisato omogeneizzato in un becher e aggiungere ATP (soluzione madre 0,1 M; pH 7,0) in modo che la concentrazione finale di ATP sia di 1 mM. Mescolare per 15 minuti in una cella fredda. L'ATP dissocia la miosina attiva dall'actina, consentendone la separazione nella successiva fase di centrifugazione. È quindi essenziale procedere immediatamente alla fase successiva per ridurre al minimo la possibilità di deplezione dell'ATP e di rilegame con l'actina.
   6. Centrifugare i lisati a 48.000 x g per 1 ora a 4 °C. Mentre ciò si verifica, iniziare a lavare 1-5 ml di un impasto al 50% di resina di affinità Anti-FLAG (per un pellet formato da 1 L di cellule) con 100 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), secondo le istruzioni del produttore. Ad esempio, per 5 mL di resina, lavare 10 mL di un impasto al 50%. Nella fase finale del lavaggio, risospendere la resina con 1-5 mL di PBS con un volume sufficiente a creare un impasto al 50%.
   7. Dopo la centrifugazione del lisato, unire il surnatante con l'impasto di resina lavato e agitare delicatamente nella cella frigorifera per 1-4 ore. Durante l'attesa, creare i buffer descritti nella Tabella 1 e tenerli in ghiaccio.
2. Preparazione per la purificazione dell'affinità FLAG
   1. Centrifugare la soluzione al punto 1.7 a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. La resina verrà imballata nella parte inferiore del tubo. Senza disturbare la resina, rimuovere il surnatante.
   2. Risospendere la resina in 50 mL di tampone A come descritto nella Tabella 1 e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Senza disturbare la resina, rimuovere il surnatante.
   3. Risospendere la resina in 50 mL di Buffer B come descritto nella Tabella 1 e centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C. Ripetere questo passaggio ancora una volta e risospendere la resina in 20 mL di Buffer B. Quindi, mescolare accuratamente la resina e il tampone capovolgendo delicatamente il tubo a mano per circa 10 volte.
3. Eluizione e concentrazione delle proteine
   1. Preparare 30 ml di tampone di eluizione come descritto nella Tabella 1 e lasciarlo raffreddare con ghiaccio.
   2. Installare la colonna di eluizione in una cella frigorifera. Versare delicatamente l'impasto di resina nella colonna. Lavare la colonna con 1-2 volumi di colonna di Buffer B man mano che la resina si impacchetta sul fondo, assicurandosi che la resina non si secchi.
   3. Far scorrere 1 mL di tampone di eluizione attraverso la resina e raccogliere il flusso in una provetta da 1,5 mL. Ripetere in modo tale da raccogliere 12, 1 mL di frazioni.
   4. A questo punto, esegui un test di Bradford grezzo sulle frazioni per determinare qualitativamente quali sono le frazioni più concentrate. Su una fila di una piastra a 96 pozzetti, pipettare 60 μl 1x reagente Bradford. Man mano che le frazioni vengono raccolte, mescolare 20 μL di ciascuna frazione per pozzetto. Una colorazione blu più scura indica le frazioni più concentrate.
   5. In una provetta da 50 mL, raccogliere le proteine rimanenti pipettando delicatamente il tampone di eluizione rimanente attraverso la colonna, per rilasciare l'eventuale miosina residua legata alla resina nel flusso della colonna. Questo flusso sarà concentrato nella fase successiva. Assicurarsi che la resina venga quindi rigenerata per il riutilizzo e conservata secondo le istruzioni del produttore.
   6. Raggruppare le tre frazioni più concentrate e concentrare ulteriormente il flusso nella provetta da 50 mL e le restanti frazioni da 1 mL utilizzando una provetta di concentrazione da 100.000 MWCO. Caricare il campione aggregato sulla provetta di concentrazione e centrifugare a 750 x g per 15 minuti a 4 °C e ripetere fino a quando tutte le proteine eluite sono state concentrate fino a un volume finale di circa 0,5-1 mL.
      nota: Questa dimensione dei pori consente la ritenzione delle molecole di miosina, che hanno masse diverse volte superiori al limite di peso molecolare. Le catene leggere rimangono strettamente legate ai domini motori durante questo corso temporale di concentrazione, come verificato eseguendo l'elettroforesi su gel SDS-PAGE sul prodotto finale.
4. Dialisi e congelamento rapido
   1. Preparare 2 L di tampone per dialisi, come descritto nella Tabella 1. Caricare il campione in una sacca o camera per dialisi e dializzare per una notte nella cella frigorifera.
      nota: Nel caso di M5a-HMM, dopo la dialisi notturna, la proteina sarà sufficientemente pura per l'uso nei test successivi. Se necessario, è possibile eseguire ulteriori fasi di purificazione, come la filtrazione su gel o la cromatografia a scambio ionico.
5. Recupero della miosina dopo la dialisi
   1. Per l'M5a-HMM, raccogliere con cura l'intero campione dalla camera di dialisi e centrifugare a 4 °C per 15 minuti a 49.000 x g nel caso in cui siano presenti aggregati indesiderati. Prendi il surnatante.
6. Determinazione della concentrazione e surgelazione rapida
   1. Per determinare la concentrazione del prodotto, misurare l'assorbanza utilizzando uno spettrofotometro a lunghezze d'onda 260, 280, 290 e 320 nm. Calcola la concentrazione in mg/mL (c_mg/mL) con l'equazione 1, dove A₂₈₀ rappresenta l'assorbimento a 280 nm e A₃₂₀ rappresenta l'assorbimento a 320 nm. La concentrazione risultante in mg/mL può essere convertita in μM di molecole di miosina con l'equazione 2, dove M è il peso molecolare dell'intera proteina (comprese le catene pesanti, le catene leggere, i fluorofori e tutti i tag).
      c_mg/mL = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      μM molecole = 1000c_mg/mL/M (2)
      nota: Se è necessaria una diluizione, deve essere eseguita in un tampone ad alta forza ionica. Il coefficiente di estinzione (ε) può essere determinato importando la sequenza amminoacidica della proteina in un programma come ExPASy. La resa tipica per M5a-HMM è di circa 0,5-1 mL di proteina 1-5 mg/mL. Il coefficiente di estinzione per l'M5a-HMM utilizzato in questo articolo era 0,671.
   2. Conservare la miosina purificata in uno dei due modi. Aliquotare tra 10-20 μl in una provetta a parete sottile, come una provetta con reazione a catena di polimerizzazione, e far cadere la provetta in un contenitore di azoto liquido per il congelamento rapido. In alternativa, pipettare direttamente tra 20-25 μl di miosina in azoto liquido e conservare le perle di proteine congelate in provette criogeniche sterili. In entrambi i casi, i tubi risultanti possono essere conservati a -80 °C o in azoto liquido per un uso futuro.
      nota: Poiché il test di motilità descritto di seguito richiede quantità molto piccole di proteine, la conservazione in piccole aliquote, come descritto, è economica.

2. Saggio TIRF a molecola singola

1. Preparazione vetrino coprioggetti
   1. Dividere la polvere madre in aliquote da 10 mg (in provette da 1,5 mL) di metossi-Peg-silano (mPEG) e aliquote da 10 mg di biotina-Peg-silano (bPEG). Conservare a -20 °C in un contenitore sigillato e privo di umidità e consumare entro 6 mesi.
   2. Caricare otto vetrini coprioggetti quadrati n. 1,5H (alta precisione) da 22 mm di spessore su un rack e lavare con 2-5 ml di etanolo a prova 200 seguiti da 2-5 ml di acqua distillata. Ripetere questa fase di lavaggio, terminando con l'acqua. Quindi, asciugare completamente i vetrini coprioggetti con una linea d'aria o N₂ e pulire al plasma con argon per 3 minuti.
   3. Posizionare i vetrini coprioggetti puliti su carta da filtro (90 mm) in una piastra per coltura tissutale (100 x 20 mm) e incubare in un forno a 70 °C eseguendo i seguenti passaggi.
      NOTA: La pulizia al plasma può essere sostituita con altri metodi di pulizia chimica.
   4. Preparare una soluzione di etanolo all'80% con dH₂O e regolare il pH a 2,0 utilizzando HCl. Aggiungere 1 mL di questo a un'aliquota di 10 mg di mPEG e 1 mL a un'aliquota di 10 mg di bPEG. Vortice da sciogliere, che non dovrebbe richiedere più di 30 s.
   5. Prelevare 100 μl della soluzione bPEG e aggiungere 900 μl di etanolo all'80% (pH 2,0). Questa soluzione è 1 mg/mL di bPEG. Quindi, fare una soluzione di entrambi i PEG come segue, mescolando accuratamente.
      1. 200 μL di 10 mg/mL di mPEG (concentrazione finale: 2 mg/mL).
      2. 10 μL di 1 mg/mL di bPEG (concentrazione finale: 10 μg/mL).
      3. 790 μl della soluzione di etanolo all'80% (pH 2,0).
   6. Togliete i vetrini dal forno. Erogare con cautela 100 μl di soluzione PEG al centro di ciascun vetrino coprioggetti, assicurandosi che solo la superficie superiore sia bagnata. Quindi, rimetti le barbottine in forno e incuba per 20-30 minuti.
   7. Quando i vetrini coprioggetti iniziano ad assumere un aspetto bucato, con piccoli cerchi evidenti sulla superficie, rimuovili dal forno.
   8. Lavare ogni vetrino coprioggetti con etanolo al 100%, asciugare con una tubazione d'aria e rimettere in forno. Incubare solo per il tempo necessario a creare le camere nella fase 2.
2. Preparazione della camera
   1. Pulire un vetrino da microscopio da utilizzare per la realizzazione della camera. Tagliare due pezzi di nastro biadesivo di circa 2 cm di lunghezza.
   2. Posizionare un pezzo lungo il centro del bordo lungo del vetrino del microscopio. Assicurarsi che il bordo del nastro sia allineato con il bordo della diapositiva. Posiziona il secondo pezzo di nastro a circa 2 mm sotto il primo pezzo di nastro in modo che i due siano paralleli e allineati.
   3. Prendi uno dei vetrini coprioggetti funzionalizzati dal forno (creato in 2.1). Incollare con cura il vetrino coprioggetti sul nastro in modo che il lato rivestito con PEG sia rivolto verso il basso e sia a contatto diretto con il nastro, come mostrato nella Figura 1. Utilizzando la punta di una pipetta, premere delicatamente sull'interfaccia del nastro scorrevole per assicurarsi che il vetrino coprioggetti abbia aderito correttamente al vetrino.
   4. Taglia il nastro in eccesso appeso sopra il vetrino con una lama di rasoio. Queste camere possono essere utilizzate immediatamente o posizionate in coppia in una provetta da 50 ml e conservate in un congelatore a -80 °C per un uso futuro. È importante riporlo immediatamente o la superficie si degraderà.
3. Esecuzione del test di microscopia TIRF della miosina 5a
   1. Preparare le soluzioni per il test di motilità invertita della miosina 5a descritte nella Tabella 2 e tenerle in ghiaccio.
   2. Lavare la camera con 10 μl di 50 mM MB con 1 mM DTT.
   3. Flusso in 10 μL di 1 mg/mL di BSA in 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripetere questo lavaggio altre due volte e attendere 1 minuto dopo il terzo lavaggio. Usa l'angolo di un fazzoletto di carta o di carta da filtro per far passare la soluzione attraverso il canale.
   4. Lavare con 10 μl di 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripetere questo lavaggio altre due volte.
   5. Flusso in 10 μL della soluzione di NeutrAvidin in 50 mM MB con 1 mM DTT e attendere 1 min.
   6. Lavare con 10 μl di 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripetere questo lavaggio altre due volte.
   7. Versare 10 μL di rodamina actina biotinilata (bRh-Actina) contenente 1 mM di DTT in 50 mM MB e attendere 1 min. Per questa fase, utilizzare un puntale per pipetta di grande diametro ed evitare di pipettare su e giù per ridurre al minimo il taglio dei filamenti di actina fluorescenti per garantire che i filamenti di actina lunghi possano essere attaccati alla superficie (20-30 μm o più). Un'alternativa efficace consiste nel tagliare il cono di un puntale per pipetta standard (con un'apertura di ≈1-1,5 mm).
   8. Lavare con 10 μl di 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripetere questo lavaggio altre due volte.
   9. Fluire in 30 μL di tampone finale con l'aggiunta di 10 nM di miosina 5a, quindi caricare immediatamente sul microscopio TIRF e registrare dopo aver trovato la messa a fuoco ottimale per la modalità di imaging TIRF. I tempi di esposizione compresi tra 100 e 200 ms sono appropriati con una potenza laser di 1,4 mW per l'actina e la miosina marcata con GFP. Un tempo di acquisizione appropriato per l'analisi della velocità è di 3 min.

Tabella 1: Tamponi utilizzati nella purificazione delle proteine.

Nome buffer	composizione	Fase/i utilizzata/e	Commenti
M5a Buffer di Estrazione	0,3 M NaCl	1.1	Mantieni il ghiaccio.
	15 mM MOPS, pH 7,2
	15 mM di MgCl2
	1,5 mM di EGTA
	4,5 mM NaN3
Buffer A	0,5 M NaCl	2.2	Mantieni il ghiaccio.
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM ATP
	1 mM DTT
	5 mM di MgCl2
Buffer B	0,5 M NaCl	2.3	Mantieni il ghiaccio.
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM DTT
Buffer di eluizione	0,5 M NaCl	3.1	Mantieni il ghiaccio.
	0,5 mg/mL di peptide FLAG
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	pH 7,2
M5a Tampone per Dialisi	500 mM KCl	4.1	Usa il dH freddo2O per portare al volume.
	10 mM di MgCl2
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	1 mM DTT

Tabella 2: Tamponi utilizzati nel saggio TIRF.

Nome buffer	composizione	Fase/i utilizzata/e	Commenti
4X Buffer di motilità (4X MB)	80 mM MOPS, pH 7,2		Filtro sottovuoto e conserva a 4°C
	20 mM di MgCl2
	0,4 mM EGTA
	pH 7,4
50 mM di sale Tampone di motilità (50 mM MB)	25% v/v 4X MB		Filtra sottovuoto e conserva a 4°C
	50 mM KCl
	Alzare al volume con dH2O
150 mM di tampone di motilità salina (150 mM MB)			Filtrare sottovuoto e conservare a 4°C
miosina		Vedi la ricetta "Final Buffer"	Mantenere il ghiaccio.
2 mg/mL NeutrAvidin	2 mg/mL di NeutrAvidin	3.5	Mantieni il ghiaccio.
	1 mM DTT
	Diluire in 50 mM MB
1 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA)	1 mg/mL di BSA	3.3	Mantieni il ghiaccio.
	1 mM DTT
	Diluire in 50 mM MB
200 nM rodamina-falloidina F-actina biotinilata (bRh-Actina)	200 nM rodamina-falloidina F-actina biotinilata	3.7	Evita il taglio evitando di vorticare o pipettare su e giù. Per mescolare, capovolgere delicatamente.
	1 mM DTT
	Diluire in 50 mM MB
MB con DTT	50 mM DTT	3.2, 3.4, 3.6, 3.8	Mantieni il ghiaccio.
	Diluire in 50 mM MB
Buffer finale	50 mM KCl	3.9	Aggiungi il glucosio, la glucosio ossidasi e la catalasi immediatamente prima di eseguire l'esperimento. Mantenere il ghiaccio.
	20 mM MOPS, pH 7,2
	5 mM di MgCl2
	0,1 mM EGTA
	1 mM ATP
	50 mM DTT
	1 μM di calmodulina
	2,5 mg/mL di glucosio
	100 μg/mL di glucosio ossidasi
	40 μg/mL di catalasi
	10 nM di miosina

Risultati

Figura 1: Preparazione di camere a celle di flusso funzionalizzate.(A) Iniziare con un vetrino da microscopio pulito, due pezzi di nastro biadesivo tagliati a circa 2 cm e un vetrino coprioggetti funzionalizzato. (B) Aggiungere il nastro al centro del vetrino del microscopio. (C) Attaccare il vetrino coprioggetti al nastro con il rivestimento rivolto...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2 M Soluzione di MgCl2	VWR	Codice 10128-298
5 M Soluzione di NaCl	KD Medico	RGE-3270
acido acetico	ThermoFisher Scientifico	984303
Gel anti-FLAG M2 Affinity	Millipore Sigma	Codice: A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP	Millipore Sigma	Codice: A7699
G-actina biotinilata	Citoscheletro, Inc.	AB07
Albumina sierica bovina	Millipore Sigma	Codice: 5470
bPEG-silano	Laysan Bio, Inc	Biotina-PEG-SIL-3400-1g
Concentrato di reagenti Bradford	Bio-Rad	5000006
Calmodulina		PMID: 2985564
catalasi	Millipore Sigma	C40
Linea cellulare (Sf9) in SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientifico	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Carta da filtro circolare - Saggio invertito	Millipore Sigma	WHA1001090
Compresse complete di inibitori della proteasi prive di EDTA	Millipore Sigma	5056489001	Questo deve essere conservato a 4 °C. Le compresse possono essere utilizzate direttamente o possono essere ricostituite come soluzione madre 25x sciogliendo 1 compressa in 2 mL di acqua distillata. La soluzione risultante può essere conservata a 4 °C per 1-2 settimane o almeno 12 settimane a -20 °C.
Tubi di concentrazione (100.000 MWCO)	EMD Millipore Corporation	UFC910024	L'MWCO della provetta non è necessariamente "taglia unica", purché l'MWCO sia inferiore al peso molecolare totale della proteina da purificare. L'M5a è stato concentrato con un tubo da 30.000 MWCO.
Colorante Coomassie Blu Brillante R-250	ThermoFisher Scientifico	Codice: 20278
Portavetrini coprioggetti	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Vetrini: Saggio di motilità invertita	Azer Scientifico	ES0107052
Tubi per dialisi (3500 Dalton MCWO)	Fischer Scientific	08-670-5A	Il diametro del tubo per dialisi può variare, ma il MWCO dovrebbe essere lo stesso. Le provette possono essere conservate in una soluzione alcolica al 20% a 4 °C.
DL-ditiotreitolo	Millipore Sigma	D0632
Nastro biadesivo	Deposito uffici	909955
Peptide DYKDDDDK	Script GenScript	RP10586	Questo può essere sciolto in un tampone contenente 0,1 M di NaCl, 0,1 mM di EGTA, 3 mM di NaN3 e 10 mM di MOPS (pH 7,2) fino a una concentrazione finale di 50 mg/mL. Questo può essere conservato a -20 °C come aliquote da 300 μL.
EGTA	Millipore Sigma	E4378
Colonna di eluizione	Bio-Rad	761-1550	Questi possono essere riutilizzati. Per la pulizia, sciacquare la colonna con 2-3 volumi di PBS e acqua distillata. Raffreddare la colonna a 4°C prima dell'uso.
etanolo	Fischer Scientific	Visualizzazione del materiale A4094
glucosio	Millipore Sigma	G8270
Glucosio ossidasi	Millipore Sigma	G2133
Soluzione tampone glicina, 100 mM, pH 2-2,5, 1 L	Santa Cruz Biotecnologia	SC-295018
Hcl	Millipore Sigma	320331
Kcl	Fischer Scientific	P217-500
Punte di pipette a grande orifizio	Fischer Scientific	02-707-134
Inibitore della leupeptin proteasi	ThermoFisher Scientifico	Codice: 78435
Mark12 Scala standard non colorata	ThermoFisher Scientifico	LC5677
metanolo	Millipore Sigma	MX0482
Vetrini per microscopio	Fischer Scientific	12-553-10
Mops	Fischer Scientific	BP308-100
mPEG-silano	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
NaN3	Millipore Sigma	S8032
NeutrAvidin	ThermoFisher Scientifico	Codice: 31050
NuPAGE Mini Gel Proteico da 4 a 12% Bis-Tris, 15 pozzetti	ThermoFisher Scientifico	NP0323PK2
Tampone per campioni NuPAGE LDS (4X)	ThermoFisher Scientifico	NP0007
Soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7,4	ThermoFisher Scientifico	10010023
PMSF	Millipore Sigma	Codice 78830	Il PMSF può essere prodotto come soluzione madre 0,1 M in isopropanolo e conservato a 4 °C. L'aggiunta di isopropanolo provoca la precipitazione dei cristalli, che può essere disciolta agitando a temperatura ambiente. Immediatamente prima dell'uso, il PMSF può essere aggiunto goccia a goccia a una soluzione a combustione rapida fino a una concentrazione finale di 0,1 mM.
Lamette	Deposito uffici	397492
Rodamina-Falloidina	ThermoFisher Scientifico	R415	Il materiale madre può essere diluito in metanolo al 100% fino a una concentrazione finale di 200 μM.
Sf9 Media	ThermoFisher Scientifico	Codice 12658-027	Questo deve essere conservato a 4° C. La sua durata di conservazione è di 18 mesi dalla data di produzione.
Piastra per coltura tissutale - Saggio invertito	Corning	353003	Ogni piatto di coltura tissutale può contenere circa quattro vetrini coprioggetti.
Puntali per pipette da 200 μl con lati lisci	Thomas Scientific	Codice 1158U38
attrezzatura
centrifuga	ThermoFisher Scientifico	75006590
microscopio	Nikon	Modello: Eclipse Ti con sistema H-TIRF con obiettivo TIRF 100x (N.A. 1.49)
Fotocamera per microscopio	Andor	Modello: fotocamera EMCCD iXon DU888 (formato sensore 1024 x 1024)
Scatola di controllo ambientale per microscopio	Tokai HIT	Thermobox personalizzato
Unità laser per microscopio	Nikon	LU-n4 quattro unità laser con laser a stato solido per 405 nm, 488 nm, 561 nm e 640 nm
Centrifuga da banco centrale	ThermoFisher Scientifico	Modello: CR3i
Sonicatore Misonix	Misonix	XL2020
Ultracentrifuga da tavolo Optima Max-Xp	Beckman Coulter	393315
Pulitore al plasma	Diener electronic GmbH + Co. KG	Tipo di sistema: Zepto
Sonda sonicatore (3,2 mm)	Qsonica	4418
Incubatrice standard	raccoglitore	Modello: 56
Waverly Miscelatore a tubo	Waverly	TR6E