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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale
1. Sensibilizzazione passiva delle cellule huRBL
- Centrifugare la sospensione di Ag8/siero pre-incubata per 5 minuti a 250 x g.
- Trasferire 50 μl della sospensione centrifugata di Ag8/siero in ciascun pozzetto contenente cellule huRBL senza disturbare il pellet di cellule Ag8.
- Includere il controllo dell'antigene, che sono sensibilizzate, ma non stimolate (non aggiungere antigene), che funge da indicazione per il plateau/fondo del segnale inferiore. I pozzetti di controllo del fondo e della lisi massima non devono essere sensibilizzati con il siero. Aggiungere invece 50 μl di terreno huRBL per controllare i pozzetti.
- Coprire la piastra con il coperchio e incubare per una notte a 37 °C e 5%-7% di CO2.
2. Degranulazione stimolata dall'antigene e rilascio del mediatore
- Preparare in anticipo la diluizione dell'antigene in 1 tampone di Tyrode (9,5 g/L di sali di Tyrode, 0,1% di albumina sierica bovina (BSA), 0,5 g/L di carbonato acido di sodio (NaHCO3) in dH2O). È necessaria una quantità finale di 100 μl per pozzetto.
nota: Non tutti gli allergeni, purificati da fonti naturali o prodotti in modo ricombinante, potrebbero essere stabili nel tampone di 1x Tyrode. Pertanto, eseguire i test di stabilità nel tampone di 1x Tyrode prima della procedura di analisi. In alternativa, diluire 1x il tampone di Tyrode in ossido di deuterio (D2O) per aumentare il rapporto segnale/rumore del saggio.
- Effettuare 8 diluizioni dell'antigene di interesse di una serie di diluizioni 1:10 in provette di reazione iniziando con 10 o 1 μg/mL di protein.
NOTA: Testare sempre in anticipo la serie di diluizione. In alternativa, adattare la serie di diluizione 1:10 (ad esempio, 1:5, 1:20 o 1:30) per coprire l'intera curva di rilascio. Inoltre, la concentrazione iniziale può variare a seconda della configurazione sperimentale.
- Per lavare le cellule huRBL piastrate sulla piastra a 96 pozzetti, rimuovere prima il terreno cellulare contenente sieri aspirando, capovolgendo e picchiettando accuratamente la piastra su carta assorbente.
- Lavare le celle con 200 μl di tampone 1x Tyrodes per pozzetto. Tratta tutti i pozzi allo stesso modo.
nota: Aggiungere lentamente la soluzione di lavaggio alle celle per non disturbarle.
- Lasciare agire per circa 30 s e ripetere la fase di lavaggio tre volte in totale.
- Dopo aver aggiunto la soluzione di lavaggio per l'ultima volta, lasciare la soluzione nei pozzetti fino al momento di continuare con l'aggiunta della diluizione dell'antigene.
nota: Evitare di esporre le celle all'aria per troppo tempo.
- Trasferire 100 μL di soluzione antigenica in ciascun pozzetto contenente le cellule huRBL presensibilizzate.
NOTA: Se si analizzano più parametri diversi, trasferire i singoli campioni della serie di diluizione in un'ulteriore piastra a 96 pozzetti non vincolante (utilizzare lo stesso layout della piastra huRBL) e trasferirli successivamente con una pipetta multicanale direttamente sulla piastra cellulare huRBL. In questo modo, si può evitare di esporre le celle all'aria per troppo tempo, il che potrebbe comportare scarse prestazioni del saggio (segnale basso/assente).
- Coprire i pozzetti di controllo (lisi massima e celle di fondo non sensibilizzate) con 100 μL di tampone 1x Tyrode. Non stimolare questi pozzetti di controllo con l'antigene.
- Inoltre, aggiungere 100 μl di tampone 1x Tyrode ai pozzetti sensibilizzati senza antigene della serie di diluizione, necessari per tenere conto del rilascio spontaneo indipendente dall'antigene delle cellule sensibilizzate durante l'analisi dei dati.
- Incubare le cellule huRBL per 1 ora a 37 °C e 5%-7% di CO2.
3. Misurazione della fluorescenza dell'attività della β-esosaminidasi
- Trattare i pozzetti del massimo controllo della lisi con 10 μL di Triton X-100 al 10% per pozzetto e mescolare opportunamente in modo da lisare completamente le cellule e ottenere il rilascio del 100% di β-esosaminidasi.
- Aggiungere 50 μl di soluzione di substrato in una nuova piastra a 96 pozzetti non vincolante. Soluzione di substrato per una piastra a 96 pozzetti: 5 mL di tampone per saggio citrico 0,1 M, pH 4,5; e 80 μL di 10 mM 4-metilumbelliferil N-acetil-β-D-glucosaminide.
- Trasferire 50 μL di surnatante cellulare di tutti i pozzetti nella nuova piastra contenente la soluzione del substrato.
NOTA: Pipettare con cura il surnatante dalla piastra huRBL per non distruggere le cellule huRBL.
- Incubare la piastra con la soluzione di substrato e il surnatante cellulare per 1 ora a 37 °C per consentire la conversione del substrato fluorogenico.
nota: Conservare la piastra huRBL per il test di vitalità cellulare.
- Aggiungere 100 μL di soluzione di arresto (15 g/L di glicina, 11,7 g/L di NaCl disciolto in dH2O, pH 10,7) per pozzetto.
- Misurare la fluorescenza a 360 nm di eccitazione e 465 nm di emissione utilizzando un lettore di piastre.