Saggio di rilascio dell'enzima mediatore umanizzato: un metodo immunochimico per lo screening del potenziale allergico dell'antigene del test monitorando la risposta alla degranulazione dei basofili in vitro

Abstract

Fonte: Wenger, M. et al. Humanized Mediator Release Assay come lettura della potenza degli allergeni. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, descriviamo un metodo in vitro per valutare il potenziale allergico di un antigene di indurre la degranulazione dei basofili. La β-esosaminidasi viene utilizzata come indice del rilascio di mediatore chimico e l'attività enzimatica della β-esosaminidasi viene misurata utilizzando un substrato fluorogenico.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale

1. Sensibilizzazione passiva delle cellule huRBL

1. Centrifugare la sospensione di Ag8/siero pre-incubata per 5 minuti a 250 x g.
2. Trasferire 50 μl della sospensione centrifugata di Ag8/siero in ciascun pozzetto contenente cellule huRBL senza disturbare il pellet di cellule Ag8.
   1. Includere il controllo dell'antigene, che sono sensibilizzate, ma non stimolate (non ag....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-metilumbelliferil N-acetil-β-D-glucosaminide	sigma	Codice: M2133
Piastra a 96 pozzetti per cellule huRBL (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Deltatreated, micropiastra a fondo piatto)	ThermoFisher Scientifico	167008
Piastra a 96 pozzetti per soluzione di substrato e surnatante cellulare (micropiastre Greiner BioOne a 96 pozzetti non trattate)	Fisher Scientifico	655101
Albumina sierica bovina (BSA)	sigma	10735078001
acido citrico	Applichem	131018
glicina	Applichem	A3707
Cloruro di sodio (NaCl)	Applichem	Codice: A2942
Carbonato acido di sodio (NaHCO3)	Applichem	131638
Triton X-100	sigma	X100
Sale di Tyrode	sigma	T2145