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1. Screening ad alto rendimento per l'inibizione della crescita (HTS)
NOTA: L'attività inibitoria della crescita degli agenti antitumorali contro gli organoidi tumorali (PDO) derivati da pazienti viene valutata misurando il contenuto intracellulare di ATP, come mostrato nella Figura 1. Questa fase viene eseguita utilizzando un kit di saggi di vitalità cellulare disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali).
- Il giorno 0, coltivare le PDO (ad es. RLUN007) in fiasche fino a quando non è disponibile un numero adeguato di cluster cellulari per il saggio. Un giorno prima della semina, trasferire la sospensione PDO da un pallone da 75 cm2 a una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 2 minuti per misurare il volume del pellet DOP. Quindi, risospendere il pellet PDO in 15 mL di terreno fresco e trasferirlo nuovamente in un matraccio da 75 cm2. Coltura delle cellule a 37 °C in CO2,
al 5%
nota: Il volume di pellet PDO richiesto dipende dalla velocità di diluizione di ciascun PDO e dal numero di piastre da 384 pozzetti utilizzate per il saggio. Per RLUN007, sono necessari 200 μL di volume di pellet cellulare per la semina in dieci piastre da 384 pozzetti.
- Il giorno 1 (24 ore dopo il cambio del terreno), tritare le PDO utilizzando un'apparecchiatura per la frammentazione e la dispersione cellulare (vedi Tabella dei materiali) con un portafiltro contenente un filtro a maglie da 70 μm. Quindi, diluire 15 mL di sospensione PDO per 10x. Seminare 40 μl della sospensione PDO in micropiastre sferoidi a bassissimo attacco (fondo tondo) a 384 pozzetti (vedi Tabella dei materiali) utilizzando un dosatore di sospensione cellulare (vedi Tabella dei materiali).
nota: Per la macinazione di cluster cellulari, si consiglia di utilizzare le apparecchiature per la frammentazione e la dispersione cellulare disponibili in commercio (vedere la Tabella dei materiali).
- A 24 ore dalla semina (giorno 2), trattare le PDO con 0,04 μl di soluzioni di agente in esame a intervalli di concentrazione finali compresi tra 20 μM e 1,0 nM (10 diluizioni seriali) utilizzando un agente di trattamento dei liquidi (cfr. tabella dei materiali).
- Il giorno 8 (144 ore dopo il trattamento con la sostanza in esame), aggiungere il reagente intracellulare per la misurazione dell'ATP ai pozzetti del campione. Miscelare le piastre con un miscelatore e incubare per 10 minuti a 25 °C. Misurare il contenuto intracellulare di ATP sotto forma di luminescenza con un lettore di piastre (vedere la Tabella dei materiali).
- Per calcolare la vitalità cellulare, dividere la quantità di ATP nei pozzetti di prova per quella nei pozzetti di controllo contenenti il veicolo, sottraendo lo sfondo. Per calcolare il tasso di crescita su 6 giorni, dividere la quantità di ATP nei pozzetti di controllo del veicolo per quella nei pozzetti di controllo del veicolo 24 ore dopo la semina.
- Calcolare i valori della concentrazione inibitoria del 50% (IC50) e dell'area sotto la curva (AUC) dalle curve dose-risposta utilizzando un software di analisi dei dati biologici (vedere la Tabella dei materiali). Il fattore Z è un parametro adimensionale che va da 1 (separazione infinita) a <0, definito come Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, dove σc+, σc-, μc+ e μc- sono le deviazioni standard (σ) e le medie (μ) dei controlli alto (c+) e basso (c-), rispettivamente.
