Azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando: una tecnica ad alto rendimento per identificare le proteine intracellulari leganti il secondo messaggero nucleotidico batterico

Abstract

Fonte: Schicketanz, M. L., et al. Identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando (DRaCALA). J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando, una tecnica per lo screening sistematico ad alto rendimento delle proteine leganti il secondo messaggero nucleotidico intracellulare. Questa tecnica consente il legame diretto dei messaggeri con la proteina bersaglio sovraespressa nel lisato cellulare, bypassando la necessità di purificazione delle proteine.

Protocollo

1. Preparazione di lisati cellulari interi

1. Inoculare i ceppi da collezione ASKA ORFeome di E. coli K-12 in 1,5 mL di brodo di lisogenesi (LB) contenente 25 μg/mL di cloramfenicolo in piastre a 96 pozzetti. Far crescere durante la notte (O/N) per 18 ore a 30 °C con agitazione a 160 giri/min. Il giorno successivo, aggiungere isopropil β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) (0,5 mM finali) alle colture O/N per indurre l'espressione proteica a 30 °C per 6 ore.
2. Celle di pellet a 500 x g per 10 min. Congelare i pellet a -80 °C fino al momento dell'utilizzo. Per lisare le cellule, aggiungere 150 μL di tampone di lisi L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, integrato con 2 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 40 μg/mL di DNasi 1 e 0,5 mg/mL di lisozima) per risospendere il pellet.
3. Congelare le cellule a -80 °C per 30 minuti, quindi scongelarle a 37 °C per 20 minuti. Ripetere questo ciclo tre volte per lisare le cellule. Conservare i lisati a -80 °C prima dell'uso.

2. Purificazione di Rel_seq e GppA

NOTA: Le proteine ricombinanti Rel_seq da Streptococcus equisimilis e GppA da E. coli K-12 sono utilizzate per sintetizzare rispettivamente pppGpp e ppGpp radiomarcati.

1. Coltiva e raccogli le cellule che sovraesprimono ogni proteina.
   1. Far crescere il ceppo BL21 DE3 di E. coli fino alla fase esponenziale (densità ottica (OD) ~0,3-0,4) in brodo LB e centrifugare 1 mL di coltura a 6000 x g per 5 min. Decantare il surnatante e risospendere le cellule con 100 μL di brodo TSB ghiacciato (brodo LB integrato con 0,1 g/mL di PEG3350, 0,05 mL/mL di dimetilsolfossido, 20 mM di MgCl₂).
   2. Mescolare i plasmidi recanti relseq e gppA marcati con istidina, ciascuno da 100 ng, con le sospensioni cellulari di cui sopra in TSB e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Shock termico delle cellule a 42 °C per 40 secondi. Mettere la miscela sul ghiaccio per 2 minuti e aggiungere 1 ml di brodo LB a temperatura ambiente per consentire alle cellule di riprendersi per 1 ora a 37 °C con agitazione a 160 giri/min.
   3. Piastra le cellule recuperate su piastre di agar LB integrate con gli antibiotici corrispondenti (Rel_seq:100 μg/mL di ampicillina; GppA: 30 μg/mL di kanamicina). Il giorno successivo, inoculare le colonie in brodo LB per iniziare le precolture O/N di entrambi i ceppi a 37 °C.
   4. Dopo 18 ore, inoculare 500 mL di terreno LB con 10 mL di colture O/N e gli antibiotici corrispondenti. Coltiva le colture agitando a 160 giri/min a 37 °C. Quando l'OD_600nm raggiunge 0,5-0,7, indurre l'espressione proteica aggiungendo 0,5 mM di IPTG e crescendo per 3 ore a 30 °C con agitazione a 160 giri/min.
   5. Raccogliere le celle centrifugando a 6084 x g per 10 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet in 20 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ghiacciato e centrifugare nuovamente a 1912 x g per 20 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante e congelare i pellet a -20 °C prima dell'uso.
2. Purificazione per affinità con acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA
   nota: Da questo punto in poi, assicurarsi che i campioni siano freddi.
   1. Aggiungere 40 mL di tampone di lisi ghiacciato L2 (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% glicerolo, 10 mM imidazolo, 10 mM β-mercaptoetanolo integrato con inibitori della proteasi (compressa priva di EDTA; vedere la Tabella dei materiali) per risospendere il pellet. Lisi le cellule tramite sonicazione (60% di ampiezza, 2 s ON/ 4 s OFF per 8 min ON). Eliminare il lisato centrifugando a 23,426 x g per 40 minuti a 4 °C e continuare con il surnatante per la purificazione.
   2. Durante la centrifugazione di cui sopra, preparare la resina Ni-NTA.
      1. Trasferire 500 μl di resina Ni-NTA omogeneizzata in una colonna cromatografica in polipropilene in piedi, lasciarla riposare per 15 minuti e far defluire la soluzione di conservazione. Lavare due volte la resina con 15 mL di acqua ultrapura, quindi lavare la colonna con 15 mL del tampone di lisi L2.
   3. Caricare il surnatante chiarificato del lisato cellulare dal passaggio 1 sulla colonna e lasciarlo fluire. Lavare la colonna con 30 mL di tampone di lavaggio (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolo, 20 mM imidazolo).
   4. Eluire le proteine con 400 μL del tampone di eluizione (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolo, 500 mM imidazolo) tre volte. Quindi, ripetere l'eluizione con altri 300 μl del tampone di eluizione. Combinare le proteine eluite fino a un volume finale di 700 μL.
3. Filtrazione su gel
   1. Preparare il tampone di filtrazione in gel (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerolo). Lavare la colonna di esclusione dimensionale con un volume di colonna (25 mL) del tampone di filtrazione in gel.
   2. Caricare il campione di oltre 700 μL utilizzando un loop da 500 μL, farlo funzionare a 0,5 mL/min e raccogliere 2-3 frazioni, ciascuna di 0,5 mL di volume, contenenti le rispettive proteine.
   3. Combinare e concentrare le frazioni contenenti ciascuna delle proteine utilizzando una colonna di rotazione e misurare la concentrazione proteica utilizzando il saggio di Bradford.

3. Sintesi di ³²pppGpp e ppGpp marcati con P

1. Assemblare una reazione Relseq su piccola scala in un tubo con tappo a vite (vedi Tabella 1).
   nota: Lavorare con i reagenti radioattivi solo in un luogo autorizzato e con dispositivi di protezione individuale.
2. Incubare la provetta a 37 °C in un termomiscelatore per 1 ora, quindi a 95 °C per 5 minuti e metterla in ghiaccio per 5 minuti. Centrifugare la proteina precipitata a 15.700 x g per 5 minuti e trasferire il surnatante (sintetizzato ³²P-pppGpp) in una nuova provetta con tappo a vite.
3. Per sintetizzare ³²P-ppGpp da ³²P-pppGpp, trasferire metà del prodotto ³²P-pppGpp in una nuova provetta con tappo a vite e aggiungere 1 μM di GppA. Incubare la provetta a 37 °C per 10 minuti, a 95 °C per 5 minuti, quindi porre in ghiaccio per 5 minuti.
4. Far girare la proteina precipitata a 15.700 x g per 5 minuti e trasferire il surnatante (sintetizzato ³²P-ppGpp) in una nuova provetta con tappo a vite.
5. Analizzare i ³²P-pppGpp e i ³²P-ppGpp eseguendo 1 μL dei campioni su una piastra per cromatografia su strato sottile (TLC) (piastre TLC di cellulosa modificata con polietilenimmina) utilizzando 1,5 M KH₂PO₄, pH 3,4, come fase mobile.
   nota: Utilizzare la guanosina 5'-trifosfato marcata con ^α-32P (³²P-α-GTP) come controllo.
6. Asciugare completamente la lastra TLC, posizionarla tra una cartella di plastica trasparente ed esporla a uno schermo al fosforo per 5 minuti. Visualizzare e quantificare i segnali utilizzando un phosphorimager.
   nota: Quando i rapporti di ³²P-pppGpp e ³²P-ppGpp sono superiori all'85%, è possibile assemblare e sintetizzare una reazione su larga scala (500 μL, sufficiente per lo screening di 20 piastre da 96 pozzetti) utilizzando la Tabella 1.

4. Screening DRaCALA delle proteine bersaglio di (p)ppGpp

1. Scongelare e trasferire 20 μl di lisati cellulari interi in una piastra per microtitolazione con fondo a V a 96 pozzetti. Aggiungere 2,5 U/pozzetto di endonucleasi di Serratia marcescens e incubare a 37 °C per 15 minuti per ridurre la viscosità del lisato. Mettere i lisati sul ghiaccio per 20 minuti.
2. Miscelare i ³²P-pppGpp e ^{i 32}P-ppGpp in un rapporto 1:1 e aggiungere 1x tampone di lisi L1 per ottenere la concentrazione finale di (p)ppGpp pari a 4 nM.
   nota: Data la somiglianza chimica tra ppGpp e ppGpp, una miscela di entrambe le sostanze chimiche semplificherà il processo di screening.
3. Utilizzare una pipetta multicanale e puntali per pipette filtrati per aggiungere e miscelare 10 μl della miscela (p)ppGpp con il lisato cellulare. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
4. Lavare lo strumento a spillo 96 x mettendolo in una soluzione allo 0,01% di detersivo non ionico per 30 s e asciugarlo su carta velina per 30 s. Ripetere il lavaggio dello strumento a spillo 3 volte.
5. Posizionare lo strumento a spillo nelle piastre campione a 96 pozzetti sopra e attendere 30 s. Sollevare lo strumento a spillo verso l'alto e posizionarlo verso il basso su una membrana di nitrocellulosa per 30 s.
   nota: Se manca un punto, individuare 2 μl dei campioni corrispondenti con una pipetta e puntali filtrati. Si consiglia di fare un punto duplicato dello stesso campione come indicato di seguito.
6. Asciugare la membrana per 5 minuti a RT. Posizionare la membrana tra una cartella di plastica trasparente ed esporla a uno schermo al fosforo per 5 minuti. Visualizzare utilizzando un phosphorimager.

5. Quantificazione e identificazione di potenziali proteine bersaglio

1. Utilizzare il software di analisi associato al phosphorimager per aprire il file .gel delle piastre visualizzate. Utilizzare la funzione di analisi Array per definire i 96 punti impostando una griglia di 12 colonne x 8 righe.
2. Definisci dei grandi cerchi per circoscrivere il bordo esterno di tutti i punti (vedi Figura 1). Esporta il Volumn+Sfondo e l'Area dei grandi cerchi definiti e salva in un foglio di calcolo.
   nota: Se necessario, riposiziona ogni singolo cerchio in modo che si sovrapponga perfettamente ai punti e ridimensiona ogni singolo cerchio per renderlo leggermente più grande del punto effettivo.
3. Ridimensiona i cerchi definiti per circoscrivere i piccoli punti interni. Esporta il Volumn+Sfondo e l'Area dei piccoli cerchi definiti e salva in un foglio di calcolo.
4. Calcolare le frazioni di legame nel foglio di calcolo utilizzando l'equazione nella Figura 1 e tracciare i dati. Identificare le potenziali proteine leganti nei pozzetti che mostrano frazioni di legame elevate rispetto alla maggior parte degli altri pozzetti.

Tabella 1: Assemblaggio delle informazioni per le reazioni di sintesi su piccola e grande scala di ³²pppGpp marcati con P. *10x tampone Relseq contiene 250 mM di Tris-HCl, pH 8,6; 1M di NaCl; 80 mM di MgCl₂. Abbreviazione: pppGpp = guanosina pentafosfato.

	Volume (μL)
	Piccola scala	Su larga scala
Acqua ultrapura
10x buffer Relseq*	numero arabo	50
ATP (8 mM finale)
Relseq (4 μM finale)
32P-α-guanosina trifosfato (GTP) (finale 120 nM) (ATTENZIONE)	0,2	5
totale	20	500

Risultati

Figura 1: Quantificazione e calcolo della frazione di legame. Vedere il testo per i dettagli. In breve, le macchie di DRaCALA saranno analizzate disegnando due cerchi che circoscrivono l'intera macchia e il punto scuro interno (cioè il (p)ppGpp trattenuto a causa del legame della proteina testata). Il segnale di legame specifico è il segnale radioattivo del cerchio interno (S₁) ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
32P-α-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 x strumento a spillo	V&P Scientifico	VP 404	Replicatore a 96 bulloni, su centri 9 mm, diametro bulloni 4,2 mm, lunghezza 24 mm
Piastra per microtitolazione con fondo a V a 96 pozzetti	Sterilizzare	MIC9004	Micropiastra Sterilin V Well 611V96
agar	OXOID - Thermo Fisher	LP0011	Agar n. 1
Ceppo da collezione ASKA	NBRP, SHIGEN, GIAPPONE		Rif: Ricerca sul DNA, Volume 12, Numero 5, 2005, Pagine 291-299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonase	sigma	E1014-25KU	endonucleasi geneticamente modificata da Serratia marcescens
Colorante per il dosaggio delle proteine Bradford	Bio-Rad	5000006	Reagente concentrato
Dmso	sigma	D8418	≥99,9%
DNasi 1	sigma	DN25-1G
per filtrazione su gel10x300 a colonna	GE Sanità	28990944	contiene il 20% di etanolo come conservante
glicerolo	PanReac AppliChem	Codice 122329.1214	Glicerolo 87% per analisi
Ipercassetta	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
Imidazolo	sigma	Codice: 56750	puriss. p.a., ≥ 99,5% (GC)
Schermo al fosforo per l'archiviazione IP	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
Isopropil β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG)	sigma	I6758	Isopropil β-D-tiogalattoside
Brodo di lisogenia (LB)	Invitrogen - Thermo Fisher	12795027	Miller's LB Brodo Base
lisozima	sigma	L4949	dall'albume d'uovo di gallina; BioUltra, polvere liofilizzata, ≥98%
MgCl2 (cloruro di magnesio)	sigma	208337
MilliQ acqua			acqua ultrapura
pipetta multicanale	Termo Scientifico	4661110	F1 - Punta a clip; 1-10 ul, 8 canali
NaCl	Prodotti chimici VWR	Codice 27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarosio	Qiagen	Telefono 30230
Membrana assorbente in nitrocellulosa	Amersham Protran	10600003	Premium 0,45 um 300 mm x 4 m
Pbs	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Soluzione salina tamponata con fosfato (Dulbecco A), Compresse
PEG3350 (Polietilenglicole 3350)	sigma	202444
fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF)	sigma	Codice 93482	Soluzione di fenilmetanosulfonilfluoruro - 0,1 M in etanolo (T)
Imager al fosforo	GE Sanità	28955809	Typhoon FLA-7000 Imager al fosforo
Puntali per pipette, filtrati	Termo Scientifico	94410040	ClipTip 12,5 μl non sterile
Colonna per cromatografia Poly-Prep	Bio-Rad	7311550	colonna cromatografica in polipropilene
Inibitore della proteasi Mini	perforare	Visualizzazione del materiale A32955	Compresse senza EDTA
tubo con tappo a vite	Termo Scientifico	3488	Provette per microcentifughi, 2,0 ml con tappo a vite, non sterili
Piastre a pozzetti profonde SLS 96	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, FONDO A V, naturale
colonna di rotazione	Millipore	UFC500396	Filtri centrifughi Amicon Ultra -0,5 ml
Termomiscelatore	Eppendorf	5382000015	Termomiscelatore C
Piastra TLC (PEI-cellulosa F Lastre TLC)	Merck Millipore	105579	DC PEI-cellulosa F (20 x 20 cm)
Tris	sigma	BP152	Tris Base per Biologia Molecolare
Interpolazione 20	sigma	P1379	detergente viscoso non ionico
β-mercaptoetanolo	sigma	Codice: M3148	99% (GC/titolazione)