Saggio di imaging con sonda fluorescente: una tecnica per visualizzare lo stress ossidativo nelle cellule organoidi intestinali in coltura trattate con induttore di specie reattive dell'ossigeno

Abstract

Fonte: Stedman, A. et al., Analisi dello stress ossidativo negli organoidi intestinali murini utilizzando la sonda fluorogenica reattiva sensibile alla specie dell'ossigeno. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video descrive la tecnica di visualizzazione dello stress ossidativo in organoidi coltivati. Questo lavoro aiuta a comprendere il livello di stress ossidativo dovuto all'accumulo di ROS nei vari tipi di cellule presenti in un organoide dopo il trattamento con diversi modulatori di ROS.

Protocollo

1. Visualizzazione dello stress ossidativo in organoidi 3D mediante microscopia confocale

1. Prendere gli organoidi placcati nelle camere a 8 pozzetti μ-Slide e aggiungere 1 μL di N-acetil cisteina o soluzione madre NAC nei pozzetti corrispondenti per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.
2. Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% CO₂.
3. Aggiungere 1 μL di soluzione madre di tBHP nei pozzetti corrispondenti per ottenere una concentrazione finale di 200 μM.
4. Incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO₂.
5. Aggiungere 1 μL per pozzetto della diluizione di 1,25 mM della sonda fluorogenica per ottenere una concentrazione finale di 5 μM.
6. Aggiungere 1 μL per pozzetto della diluizione di 1,25 mg/mL di Hoechst per ottenere una concentrazione finale di 5 μg/mL.
7. Incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO₂.
8. Rimuovere il fluido senza disturbare il BMM. Aggiungere delicatamente, 250μl di DMEM caldo senza rosso fenolo.
   nota: Se è prevista un'acquisizione a lungo termine, aggiungere composti di fattori di crescita al DMEM senza rosso fenolo.
9. Imaging degli organoidi utilizzando un microscopio confocale dotato di camera termica e alimentazione di gas che rileva la sonda fluorogenica (ROS).
   nota: L'eccitazione/emissione (ex/em) per la sonda fluorogenica è 644/665, ex/em per Hoechst (nuclei) è 361/486 ed ex/em per GFP (cellule staminali intestinali dai topi Lgr5-GFP) è 488/510. Un obiettivo a immersione in olio 63x viene utilizzato per rilevare i segnali nelle cellule staminali. Non modificare le impostazioni del laser tra i campioni. Un obiettivo 20x potrebbe essere utilizzato per consentire una panoramica della produzione di ROS.
10. Utilizzare il controllo positivo per impostare l'intensità del laser e il tempo di esposizione per il segnale ROS e verificare che questo segnale sia inferiore nel controllo negativo.
11. Utilizzando l'oculare, eseguire lo screening del vetrino per identificare gli organoidi GFP che esprimono e regolare l'intensità del laser.
    nota: Questo passaggio viene eseguito manualmente.
12. Definisci le posizioni per ottenere un'immagine cucita dell'intero organoide. Impostare uno z-stack di 25 μm (dimensione del passo 5 μm) per ottenere una sezione degli organoidi che mostri uno strato di cellule.
    nota: Fare riferimento al manuale utente del microscopio per ottimizzare la configurazione. Utilizzando cellule viventi, l'acquisizione deve essere effettuata entro 1 ora dalla fine dell'incubazione.
13. Aprire le immagini in un software di elaborazione delle immagini open source (vedere la tabella dei materiali).
14. Passa attraverso lo z-stack e scegli la sezione in cui il centro degli organoidi è ben rappresentato e crea una nuova immagine con l'area selezionata.
15. Quantifica le immagini secondo i passaggi seguenti.
    1. Selezionare lo strumento linea a mano libera.
    2. Traccia una linea seguendo i nuclei.
       nota: Selezionare solo le regioni che presentano cellule GFP-positive se vengono analizzate solo le cellule staminali.
    3. Aumentare la larghezza della linea per coprire lo strato della cella con la linea senza includere i detriti luminali.
    4. Selezionare il canale per il segnale ROS e misurare l'intensità della fluorescenza nella regione selezionata e annotare i valori.
    5. Traccia una linea dove non c'è segnale e misura l'intensità fluorescente dello sfondo che verrà sottratta dal valore precedente per ottenere l'intensità finale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
topi
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5- GFP)	Il laboratorio Jackson
Terreno di coltura di crescita
DMEM avanzato F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
Penicillina-streptomicina (P/S)	ThermoFisher	15140122	Concentrazione di riserva: 100x (10.000 unità/mL di penicillina e 10.000 μg/mL di streptomicina)
FLuoroBrite DMEM (DMEM senza rosso fenolo)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	stock a 10 mg/mL
Matrigel Fattore di crescita ridotto, privo di rosso fenolo (matrice della membrana basale)	Corning	356231	una volta ricevuto scongelare in frigorifero, conservare per 1h in ghiaccio e, fare 500 mL di aliquote e conservare a -20 °C
μ-Slide 8 camere a pozzetti	Ibidi	Codice 80826
N-acetilcisteina (NAC)	sigma	Codice: A9165
soluzione di terz-butile idroperossido (tBCHP) (70% in peso). In H2O2)	sigma	458139
Programmi e attrezzature
Figi/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ scarica la generazione di immagini
Osservatore.Z1	Zeiss		sistema confocale
Opterra (confocale a campo spazzato)	Bruker		sistema confocale
telecamera EMCCD ad alta velocità Evolve Delta 512	Fotometria		sistema confocale
prisma	Software GraphPad		analisi statistica