Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di reagenti e materiali per la coltura di organoidi intestinali
- Per preparare il terreno di coltura di crescita, mescolare DMEM/F-12 avanzato integrato con 1x glutammina, 1x soluzione di penicillina/streptomicina (P/S), 10 mM di HEPES, 50 ng/mL di EGF murino, 20 μg/mL di Noggin murino, 500 ng/mL di R-spondin1 di topo (vedi Tabella dei materiali). Lasciare il mezzo a temperatura ambiente (RT) durante l'estrazione della cripta.
nota: Congelare il fluido non utilizzato in aliquote a -20 °C. Evitare il congelamento e lo scongelamento.
- Riempi una provetta da 50 mL con 40 mL di Advanced DMEM/F-12 e tienila in ghiaccio.
nota: Mantenere il fluido inutilizzato a 4 °C. Verrà utilizzato per il passaggio degli organoidi.
- Preriscaldare le piastre per colture cellulari (fondo tondo a 96 pozzetti) nell'incubatore a 37 °C.
- Scongelare le aliquote della matrice della membrana basale (BMM) (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio (prima di iniziare il protocollo o almeno 1 ora prima di placcare le cripte).
nota: Il BMM si solidificherà rapidamente se non viene mantenuto freddo.
- Preparare la soluzione di lavaggio/lavaggio aggiungendo una soluzione di penicillina-streptomicina all'1% a DPBS (DPBS-P/S).
- Riempire una capsula di Petri da 100 mm con 10 mL di DPBS-P/S freddo. Riempire sei provette da 15 mL con 10 mL di DPBS ed etichettarle da F1 a F6.
- Preparare 30 mL di soluzione di EDTA 10 mM mediante diluizione da 0,5 M EDTA in DPBS. Riempire due provette da 15 mL con 10 mL di EDTA da 10 mM ed etichettarle con i numeri E1 ed E2.
- Conservare tutte le soluzioni pre-raffreddate a 4°C e tenerle sul ghiaccio durante la procedura.
2. Coltura di organoidi intestinali
- Sacrificare un topo Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) di 8-10 settimane secondo le norme e i regolamenti nazionali.
- Raccogliere 5-8 cm di digiuno che abbraccia la regione compresa tra il duodeno (5 cm dallo stomaco) e l'ileo (10 cm dal cieco) e conservare in DPBS-P/S freddo su ghiaccio.
- Pulire il contenuto intestinale sciacquando con 5-10 ml di DPBS-P/S.
nota: Le siringhe di lavaggio fatte in casa possono essere ottenute inserendo un puntale da 200 μL su un ugello da 10 mL.
- Aprire l'intestino longitudinalmente utilizzando le forbici a punta sferica (vedi Tabella dei materiali) (per evitare di danneggiare il tessuto).
- Usando una pinza, trasferire il tessuto in una capsula di Petri contenente DPBS-P/S freddo a temperatura ambiente e agitarlo per risciacquare.
- Con una pipetta di plastica Pasteur, afferrare l'intestino per aspirazione e trasferirlo in una provetta da 15 ml etichettata E1 contenente 10 ml di EDTA freddo da 10 mM.
- Capovolgere la provetta 3 volte e incubare con ghiaccio per 10 minuti.
- Utilizzando una pipetta di plastica Pasteur, trasferire il fazzoletto nella provetta F1 contenente 10 mL di DPBS. Vortice per 2 minuti (a vortice normale, tenendo il tubo con la mano e assicurandosi che l'intestino ruoti bene).
- Mettere 10 μl della frazione in una capsula di Petri e valutare la qualità della frazione al microscopio.
nota: Tutti i passaggi del vortice vengono eseguiti alla massima velocità e la qualità di ciascuna frazione deve essere valutata al microscopio (Figura 1).
- Con una pipetta di plastica Pasteur, afferrare l'intestino per aspirazione e trasferirlo nella provetta F2 contenente 10 mL di DPBS e vortice per 2 min.
- Ripetere il passaggio 2.10, trasferendo il tessuto nella provetta F3 contenente 10 mL di DPBS e vortex per 2 minuti.
- Ripetere l'incubazione dell'EDTA come al punto 2.6, trasferendo il tessuto nella provetta E2 contenente 10 mM di EDTA.
- Capovolgere la provetta 3 volte e incubare con ghiaccio per 5 minuti.
- Ripetere il passaggio 2.10, trasferendo il tessuto nella provetta F4 contenente 10 mL di DPBS e vortex per 3 minuti.
- Ripetere il passaggio 2.14, trasferendo il tessuto nella provetta F5 contenente 10 mL di DPBS e vortex per 3 minuti.
- Ripetere il passaggio 2.15, trasferendo il tessuto nella provetta F6 contenente 10 mL di DPBS e vortex per 3 minuti.
- Combina le migliori frazioni filtranti per gravità attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta da 50 ml (su ghiaccio) per eliminare villi e detriti significativi.
nota: Di solito, F5 e F6 sono le frazioni che contengono numerose cripte e meno detriti.
- Centrifugare le cripte a 150 x g a 4 °C per 3 min.
- Svuotare la provetta, rompere meccanicamente il pellet e aggiungere 5 ml di DMEM/F12 freddo.
- Mettere 10 μL della sospensione in una capsula di Petri e contare manualmente al microscopio il numero di cripte presenti nell'aliquota.
nota: Non contare singole celle o piccoli detriti.
- Calcola il volume (V) della sospensione delle cripte richiesto in μL, considerando che 300 cripte sono piastrate per pozzetto, W è il numero di pozzetti e N è il numero di cripte contate su 10 μL di sospensione. Trasferisci le cripte in una nuova provetta da 15 mL.
nota: V = 300 x L x 10/N. Se nell'esperimento pianificato si utilizza un volume ridotto, è possibile utilizzare una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
- Centrifugare le cripte a 200 x g a 4 °C per 3 min.
- Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta.
- Disgregare meccanicamente il pellet e aggiungere delicatamente il terreno di coltura per ottenere una concentrazione di 90 cripte/μL.
- Aggiungere 2 volumi di BMM non diluito per ottenere una concentrazione finale di 30 cripte/μl. Pipettare accuratamente su e giù senza introdurre bolle d'aria nella miscela.
nota: Tenere sempre il tubo sul ghiaccio per evitare la solidificazione del BMM.
- Piastra 10 μL delle cripte/BMM miscelare in ciascun pozzetto. Per l'analisi della citometria a flusso, utilizzare piastre a fondo tondo a 96 pozzetti. Distribuire 10 μl al centro di ciascun pozzetto come una cupola.
nota: Piastra gli organoidi come uno strato sottile per il test di imaging per consentirne l'imaging approfondito.
- Lasciare la piastra per 5 minuti a RT per consentire al BMM di solidificarsi. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 15 minuti.
- Aggiungere 250 μl di terreno di coltura in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non staccare il BMM.
- Posizionare le piastre nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
- Eseguire l'analisi dei ROS tra il 4° e il 6° giorno di coltura. In caso contrario, cambiare il terreno e dividere gli organoidi dopo la comparsa di diverse strutture a germogliamento lungo e quando le cellule morte si accumulano nei lumi degli organoidi.
3. Passaggio di organoidi
- Iniziare a passare gli organoidi dell'intestino tenue dal 6° giorno di coltura, quando si sono formate strutture significative in gemma e i lumi degli organoidi sono diventati scuri.
nota: Il lume dell'organoide diventa scuro a causa dell'accumulo di cellule morte, detriti e muco. Evita che gli organoidi crescano troppo prima di dividersi. Il rapporto di scissione dipende dalla crescita degli organoidi. Si consiglia di passare gli organoidi con un rapporto di 1:2 al giorno 6 e 1:3 al giorno 10.
- Riempire una provetta da 15 mL con 4 mL di Advanced DMEM/F-12 freddo e tenerla in ghiaccio.
nota: Qui vengono forniti i volumi per una piastra di coltura a 96 pozzetti. Se si utilizza un formato diverso, regolare il volume di conseguenza.
- Aspirare con cautela il mezzo con una pipetta o una pompa a vuoto dai pozzetti senza toccare le cupole BMM e gettarlo.
- Aggiungere 100 μL di Advanced DMEM/F-12 freddo per pozzetto. Pipettare su e giù per rompere il BMM e trasferire il contenuto del pozzetto nella provetta da 15 mL.
- Lavare il pozzetto con 200 μL di DMEM/F-12 freddo Advanced e raccoglierlo nella stessa provetta.
nota: Se si passano più pozzetti dalla stessa condizione sperimentale, il contenuto dei pozzetti può essere raggruppato nella stessa provetta di raccolta da 15 mL.
- Centrifugare la provetta di raccolta da 15 mL a 100 x g per 5 minuti a 4°C.
- Scartare il surnatante e aggiungere 1 ml di Advanced DMEM/F-12 freddo al pellet. Utilizzando un puntale P1000, prendere un puntale P10 (senza filtro) e pipettare su e giù almeno 20 volte.
- Aggiungere 4 mL di Advanced DMEM/F-12 freddo alla provetta. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4°C.
- Aspirare il surnatante con una pipetta o una pompa a vuoto senza disturbare il pellet. Quindi, interrompere meccanicamente il pellet
.
- Aggiungere BMM diluito in terreno di coltura di crescita (rapporto 2:1). Pipettare con cura su e giù senza introdurre bolle d'aria nella miscela.
- Piastra 10 μL delle cripte/BMM miscelare in ciascun pozzetto.
- Tenere la piastra per 5 minuti a RT per consentire al BMM di solidificarsi. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 15 minuti.
- Aggiungere 250 μL di terreno di coltura in ciascun pozzetto.
nota: Fare attenzione a non staccare il BMM.
- Posizionare le piastre nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
4. Preparazione di reagenti e materiali per valutare lo stress ossidativo negli organoidi intestinali
- Preparare una soluzione madre 250 mM di inibitore N-acetilcisteina (NAC) (vedere la Tabella dei materiali) e risospendere 10 mg con 245 μL di DPBS. Utilizzare alla concentrazione finale di 1 mM.
- Preparare una soluzione madre da 50 mM di induttore Tert-butilidroossido (tBHP), al 70% in acqua, e diluire 3,22 μl con 496,8 μl di DPBS. Utilizzare a una concentrazione finale di 200 μM.
- Per lo studio di citometria a flusso, preparare una soluzione di lavoro da 250 μM di una sonda fluorogenica (vedere la Tabella dei materiali) diluendo la soluzione madre 1/10 in DMSO. Utilizzare alla concentrazione finale di 1 μM.
nota: Come indicato nelle istruzioni del produttore, la sonda fluorogenica è sensibile alla luce e all'ossigeno. Le scorte e le aliquote non devono essere aperte e chiuse troppe volte.
- Preparare una soluzione finale di 0,1 μg/mL di DAPI in DPBS, da utilizzare per la discriminazione delle cellule morte nel saggio di citometria a flusso.
nota: Queste fasi descrivono l'utilizzo di controlli negativi e positivi che devono essere inclusi in qualsiasi test, utilizzando le condizioni indicate nella Figura 2A. Il test può essere utilizzato per testare composti anti- o pro-ossidanti. I passaggi sono gli stessi e l'unica differenza è quando i composti vengono aggiunti prima di utilizzare il colorante fluorogenico.
5. Quantificazione dello stress ossidativo sugli organoidi dissociati utilizzando il citometro a flusso
- Aggiungere 1 μL di soluzione madre di NAC nei pozzetti per i controlli negativi per ottenere una concentrazione finale di 1 mM.
nota: Utilizzare gli organoidi placcati nelle piastre a fondo tondo a 96 pozzetti.
- Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% CO2.
- Aggiungere 1 μL di soluzione madre di tBHP nei pozzetti corrispondenti per ottenere una concentrazione finale di 200 μM.
- Incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
- Con una pipetta multicanale, rimuovere il fluido senza disturbare il BMM attaccato e trasferirlo in un'altra piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti. Tenete da parte questo piatto.
- Aggiungere 100 μl di tripsina e, con una pipetta multicanale, pipettare su e giù almeno cinque volte per distruggere il BMM.
- Incubare per non più di 5 minuti a 37 °C e 5% CO2.
- Con una pipetta multicanale, pipettare su e giù almeno cinque volte per dissociare gli organoidi.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min a RT.
- Eliminare il surnatante capovolgendo la piastra. Aggiungere nuovamente il terreno raccolto al punto 6.3 nei pozzetti corrispondenti e risospendere le cellule pipettando su e giù 5 volte.
- Aggiungere la sonda fluorogenica alla concentrazione finale di 1 μM. Aggiungere 1 μl per pozzetto dalla diluizione di 250 μM e incubare per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2,
nota: Non aggiungere la sonda fluorogenica ai pozzetti necessari per le impostazioni dello strumento (Figura 2B).
- Centrifugare a 300 x g per 5 min a RT.
- Risospendere le cellule con 250 μL di soluzione DAPI 0,1 μg/mL. Trasferire i campioni nelle apposite provette per citometria a flusso, mantenere le provette sul ghiaccio e procedere con l'analisi.
nota: Aggiungere PBS invece di DAPI ai pozzetti necessari per le impostazioni dello strumento (Figura 2B).
- Ottimizza le impostazioni della tensione di dispersione diretta e laterale su tensioni di controllo e laser non colorate per ciascun fluoroforo utilizzando campioni monocolorati.
- Utilizzando una strategia di gating appropriata (Figura 3A), raccogli un minimo di 20.000 eventi.
NOTA: sono preferibili 50.000 eventi. Le impostazioni di acquisizione dettagliate variano a seconda dello strumento utilizzato.
