1. Preparazione dei costrutti di espressione del baculovirus
- Purificare la ligasi SUMO E3 K-bZIP clonando il cDNA di K-bZIP in un vettore di baculovirus a doppia espressione (vedi Tabella dei materiali) con un tag epitopo N-terminale. Abbiamo avuto successo utilizzando un tag octapeptide (indicato in tutto il protocollo come vector-tag-K-bZIP).
nota: Il DNA stampo per il clonaggio della reazione a catena della polimerasi (PCR) K-bZIP è cDNA trascritto inversamente da RNA isolato da cellule TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 dopo il trattamento con doxiciclina.
- Trasferire il cDNA K-bZIP a lunghezza intera nel vettore a doppia espressione con i siti di clonazione CpoI. CpoI digerisce il prodotto della PCR e 1 μg del vettore di doppia espressione a 37 °C per 3 ore.
- Separare ed estrarre il DNA digerito dopo l'elettroforesi su un gel di agarosio allo 0,8%. Legare l'inserto (K-bZIP) e il vettore mediante T4 DNA ligasi a 16 °C per 30 minuti secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).
- Aggiungere 5 μL di DNA di legatura a 50 μL di cellule competenti di E. coli "A" (vedi Tabella dei materiali) in una provetta da 1,5 mL. Mettere in ghiaccio per 30 min. Quindi, incubare la provetta da 1,5 mL in un bagno d'acqua a 42 °C per 45 s e mettere immediatamente la provetta in ghiaccio per 3 minuti.
- Aggiungere 600 μl di terreno S.O.C. (0,5% (p/v) di estratto di lievito, 2% (p/v) di triptone, 10 mM di NaCl, 2,5 mM di KCl, 20 mM di MgSO4 e 4% (p/v) di glucosio) nella provetta e incubare a 37 °C per 1 ora. Quindi, centrifugare la provetta a temperatura ambiente per 3 minuti a 600 x g.
- Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet con 60 μL di terreno Luria-Bertani (LB; 1% (p/v) di triptone, 0,5% (p/v) di estratto di lievito e 85 mM di NaCl) e distribuire su piastre di agar LB contenenti 100 μg/mL di ampicillina. Incubare la piastra di agar agar a 37 °C per 16 ore.
- Selezionare 1 colonia da inoculare in un terreno da 5 mL LB contenente 100 μg/mL di ampicillina e coltura a 37 °C per 16 ore con agitazione a 250 giri/min. Quindi, estrarre il plasmide, vector-tag-K-bZIP, con un kit di estrazione del plasmide secondo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
- Generare il bacmide ricombinante che ospita il tag-K-bZIP mediante la trasformazione del vettore-tag-K-bZIP in cellule "B" competenti di E. coli (vedi Tabella dei materiali).
- Miscelare 0,2 μg di plasmide vector-tag-K-bZIP e 100 μL di E. cellule di coli "B" in una provetta da 1,5 mL e mettere in ghiaccio per 30 min. Incubare la provetta in un bagnomaria a 42 °C per 45 s e mettere immediatamente la provetta in ghiaccio per 3 minuti.
- Aggiungere 900 μl di terreno S.O.C. nella provetta e incubare a 37 °C per 4 ore con rotazione a 50 giri/min. Quindi, prelevare 10 μL del terreno e aggiungere altri 50 μL di terreno SOC da distribuire su piastre di agar LB contenenti 50 μg/mL di kanamicina, 7 μg/mL di gentamicina, 10 μg/mL di tetraciclina, 100 μg/mL di substrato di galattosidasi e 40 μg/mL di isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG), e incubare le piastre per 48 ore a 37 °C.
- Inoculare una colonia bianca in un terreno da 5 mL LB contenente 50 μg/mL di kanamicina, 7 μg/mL di gentamicina e 10 μg/mL di tetraciclina. Incubare a 37 °C con agitazione a 250 giri/min per 16 ore.
- Isolare il DNA ricombinante di bacmid che ospita il tag-K-bZIP, quantificare e risospendere a una concentrazione di 1 μg/μL.
- Generare baculovirus ricombinanti che esprimono tag-K-bZIP trasfettando 1 μg di DNA di bacmide ricombinante contenente tag-K-bZIP in cellule Sf9 in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
- Seminare 2 x 106 cellule Sf9 (vedi Tabella dei materiali) in 2 mL di Grace's Insect Medium fornito con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di gentamicina in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, quindi incubare a 27 °C per 1 ora.
- Mantenere una coltura in fase logaritmica di cellule Sf9 nel terreno per insetti di Grace fornito con il 10% di FBS, l'1% di gentamicina e l'1% di detergente C (vedere la tabella dei materiali) a 27 °C in sospensione orbitale a 140 giri/min. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e la colorazione con blu di tripano; La vitalità cellulare deve superare il 95%. Mantenere le cellule utilizzando un rapporto di subcoltura di 1:3 ogni 2-3 giorni (densità minima ~0,5 x 106 cellule/mL).
- Aggiungere 2 μL di DNA bacmide (1 μg/μL) e 98 μL di terreno sierico ridotto (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta da 2 mL. Quindi, aggiungere 4 μL di reagente di trasfezione (vedere la Tabella dei materiali) alla provetta e mescolare bene. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere questa miscela di trasfezione (104 μL) in ciascun pozzetto e incubare a 27 °C per 12-16 ore.
- Rimuovere il terreno esausto con un'aspirazione delicata e sostituirlo con 2 ml di Grace's Insect Medium fresco fornito con il 10% di FBS e l'1% di gentamicina. Le celle Sf9 aderiscono liberamente alla superficie della piastra e non vengono disturbate da un'aspirazione delicata.
- Raccogliere il baculovirus ricombinante dopo la trasfezione e amplificare il baculovirus per ottenere stock ad alto titolo (P1) per ulteriori esperimenti.
- 72 ore dopo aver cambiato il terreno, raschiare le cellule Sf9 utilizzando un sollevatore di cellule sterile, raccogliere il surnatante da ogni singolo pozzetto in una provetta da 1,5 ml e agitare per 10 s.
- Centrifugare a 4 °C per 3 minuti a 150 x g. Raccogliere il surnatante come baculovirus P0 e aliquotare in provette da 1,5 ml (1 ml di baculovirus in ciascuna provetta). Conservare a -80 °C.
- Seminare 1 x 107 cellule Sf9 in 10 mL di Grace's Insect Medium fornito con il 10% di FBS e l'1% di gentamicina in una capsula di Petri da 10 cm e incubare a 27 °C per 1 ora.
- Per l'amplificazione di baculovirus ricombinanti che esprimono tag-K-bZIP, aggiungere 0,5 mL di baculovirus P0 alle cellule Sf9 seminate e incubare a 27 °C per 48 ore.
- Raccogliere il surnatante come baculovirus P1 in una provetta da 15 ml e conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese.
2. Purificazione di K-bZIP
- Mantenere una coltura in fase logaritmica di cellule Sf9 nel terreno per insetti di Grace fornito con il 10% di FBS, l'1% di gentamicina e l'1% di detergente C a 27 °C in sospensione orbitale a 140 giri/min, come descritto al punto 1.3.2.
- Il giorno della trasduzione, aggiungere 1 mL di surnatante contenente baculovirus (P1) in 250 mL di cellule Sf9 con una densità di 2 x 106 cellule/mL.
- Incubare le cellule di Sf9 per 72 ore a 27 °C su un agitatore orbitale con agitazione a 140 giri/min, quindi raccogliere mediante centrifugazione a 2.740 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e i pellet cellulari di lisi in 10 mL di tampone di lisi (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1% detergente A (vedere la Tabella dei materiali), 2% di glicerolo, cocktail di inibitori della proteasi) e ruotare a 50 giri/min utilizzando un miscelatore in sospensione a 4 °C per 30 minuti.
- Centrifugare il lisato cellulare a 15.000 x g per 15 minuti per raccogliere il surnatante.
- Per purificare tag-K-bZIP, incubare i lisati cellulari (10 mL) con 50 μL di biglie magnetiche marcate con anticorpi in provette di polipropilene da 14 mL e ruotare a 50 giri/min per 3 ore a 4 °C utilizzando un miscelatore in sospensione. Dopo la cattura delle proteine, pellettare le perle con centrifugazione 800 x g per 30 s a 4 °C. Rimuovere la maggior parte del surnatante, risospendere le perle nel volume residuo di circa 1 mL e trasferirle in una provetta da 1,5 mL per il lavaggio.
- Lavare la proteina catturata posizionando il tubo contenente le perle su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante una volta che le perle magnetiche hanno aderito completamente al lato del tubo.
- Lavare le perle con il tampone di lisi quattro volte.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lisi in provette da 1,5 mL e capovolgere le provette 10 volte. Posizionare la provetta da 1,5 mL su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante come descritto al punto 2.7.
- Ripetere il passaggio precedente altre 3 volte.
- Lavare una volta le perle con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aggiungere 1 mL di PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) in provette da 1,5 mL e capovolgere le provette 10 volte.
- Mettere la provetta da 1,5 ml su un supporto magnetico e quindi rimuovere il surnatante.
- Eluire la proteina tag-K-bZIP dalle biglie magnetiche marcate con anticorpi aggiungendo 100 μL di octapeptide da 150 μg/mL diluito in PBS in una provetta da 1,5 mL. Ruotare il tubo per 10 minuti a 50 giri/min con un miscelatore a sospensione a temperatura ambiente. Quindi, riposizionare la provetta sul supporto magnetico e raccogliere il surnatante contenente K-bZIP in una provetta pulita da 1,5 mL.
- Analizzare la proteina tag-K-bZIP purificata da 1-5 μL mediante SDS-PAGE seguita da colorazione blu di Coomassie. Caricare campioni da 2 μg, 1 μg e 0,5 μg di albumina sierica bovina (BSA) sullo stesso gel e utilizzarlo per la quantificazione con un programma di elaborazione delle immagini, come ImageJ. Stimare la concentrazione di K-bZIP rispetto agli standard BSA.
- Il K-bZIP purificato è ora pronto per essere utilizzato in ogni saggio di SUMOilazione. Diluire il K-bZIP in PBS a una concentrazione finale di 100 ng/μl e conservare in piccole aliquote a -80 °C.
3. Saggio di sumoilazione
- Aggiungere 3 μL di 100 ng/μL di tag-K-bZIP purificato nella miscela master di ciascuna reazione di SUMOilazione in vitro. I componenti della miscela master contengono 1 μL di tampone proteico, 1 tampone di SUMOilazione, 0,5 μL di proteina p53 (0,5 mg/mL), 25 nM di enzima attivante E1 (conc. stock: 1 μM), 50 nM di enzima coniugato E2 (conc. stock: 10 μM) e 250 nM ciascuno dei peptidi SUMO (SUMO-1, SUMO-2 o SUMO-3; conc. stock: 5 μM) fino a un volume finale di 17 μL.
- Mescolare delicatamente il contenuto e incubare la reazione a 30 °C per 3 ore. Arrestare la reazione aggiungendo 20 μl di tampone di caricamento 2x SDS-PAGE (100 mM Tris-HCL pH 6,8, 4% dodecil solfato, 0,2% (p/v) blu di bromofenolo, 20% (v/v) glicerolo e 200 mM β-mercaptoetanolo) e denaturare i campioni a 95 °C per 5 minuti.
- Separare i campioni su SDS-PAGE, trasferire le proteine separate sulla membrana in PVDF utilizzando un apparato di trasferimento elettroforetico semi-secco e analizzare mediante Western blot utilizzando l'anticorpo anti-p53.
- Installare l'apparato in gel e caricare 20 μl di campione nei pozzetti in gel.
- Far funzionare il gel al 10% in corrente costante a 80 V per circa 120 minuti (fino a quando la banda di colorante raggiunge il fondo del gel). Al termine dell'elettroforesi, spegnere l'alimentazione.
- Scollegare l'apparato gel e le cassette del gel per estrarre il gel e far galleggiare il gel nel tampone di trasferimento semi-secco (48 mM Tris-HCl, 39 mM di glicina, 20% di metanolo) per 5 minuti.
- Prendi un altro contenitore e immergi la membrana in PVDF nel metanolo per 1 minuto. Quindi, estrarre il PVDF dal metanolo e metterlo nel tampone di trasferimento semi-secco. Agitare delicatamente la membrana per 5 minuti.
- Rimuovere il coperchio di sicurezza dell'apparecchio elettroforetico semisecco.
- Pre-bagnare la carta da filtro e preparare un sandwich di gel sull'anodo di platino inferiore come segue: carta da filtro, membrana PVDF, gel e carta da filtro.
- Fissare la piastra catodica e il coperchio di sicurezza, quindi eseguire il blot a una corrente costante di 15 V per 90 minuti. Spegnere l'alimentazione, scollegare l'apparecchio semisecco ed estrarre la membrana in PVDF.
- Membrana in PVDF a blocchi con tampone bloccante (5% di latte scremato in tampone TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% detergente B (vedi Tabella dei materiali), pH 7,6)) a temperatura ambiente per 1 ora con agitazione a 30 giri/min tramite agitatore orbitale.
- Ibridare la membrana PVDF con l'anticorpo anti-p53 diluito (1:1.000) in tampone bloccante per 12-16 ore a 4 °C con agitazione a 30 giri/min utilizzando un miscelatore di sospensione.
- Estrarre la membrana PVDF in un contenitore e metterla in TBST. Sciacquare la membrana PVDF con TBST altre due volte.
- Immergere la membrana PVDF in TBST per 30 minuti con agitazione a 45 giri/min tramite agitatore orbitale.
- Ibridare la membrana PVDF con anticorpo anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano (HRP) diluito (1:4.000) in tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione a 30 giri/min utilizzando un miscelatore in sospensione.
- Lavare la membrana in PVDF con TBST 3 volte come descritto al punto 3.4.10.
- Immergere la membrana PVDF in TBST per 30 minuti con agitazione a 45 giri/min utilizzando un miscelatore a sospensione. Rimuovere il TBST e aggiungere il PBS per preservare la membrana in PVDF a 4 °C per un massimo di 12 ore.
- Miscelare i reagenti 1 e 2 (1:1) del substrato chemiluminescente potenziato (substrato ECL) (vedere la Tabella dei materiali). Rimuovere la membrana in PVDF dal PBS, tamponare brevemente con un tovagliolo di carta o un panno leggero per assorbire l'umidità in eccesso e aggiungere immediatamente 400 μL di reagente ECL sulla superficie di ciascuna membrana per 3-5 minuti. Rimuovere il reagente ECL in eccesso tamponando brevemente, ma non lasciare che la membrana si asciughi completamente.
- Esporre il blot utilizzando un sistema di imaging a luminescenza o una pellicola per autoradiografia.