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1. Preparazione del reagente
- Preparare il terreno DMEM a bassa fluorescenza per i saggi utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre. Miscela 25 mM di glucosio, 0,4 mM di glicina, 0,4 mM di arginina, 0,2 mM di cisteina, 4,0 mM di glutammina, 0,2 mM di istidina, 0,8 mM di isoleucina, 0,8 mM di leucina, 0,8 mM di lisina, 0,2 mM di metionina, 0,4 mM di fenilalanina, 0,4 mM di serina, 0,8 mM di treonina, 0,078 mM di triptofano, 0,4 mM di tirosina, 0,8 mM di valina, 1,8 mM di CaCl2, 0,81 mM di MgSO4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO3, 110 mM NaCl, 0,9 mM NaH2PO4. Regolare il pH della soluzione utilizzando HCl o NaOH a pH 7,4. Sterilizzare il mezzo attraverso la filtrazione.
nota: Questo terreno contiene componenti del terreno DMEM standard con glucosio elevato, ad eccezione del fatto che Fe(NO3)3, le vitamine e il rosso fenolo sono omessi. Il fenolo rosso, la riboflavina e il piridossale nel normale terreno di coltura DMEM interferiscono in modo significativo con il rilevamento del segnale di fluorescenza. Il terreno di coltura privo di tali componenti è fondamentale per il successo dell'imaging GFP su cellule vive. Il terreno è stabile per 12 mesi se conservato in frigorifero.
2. Saggio di degradazione in tempo reale di NLS-luciferasi-GFP utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza
- Seminare circa 1 x 104 cellule HeLa in piastre di coltura tissutale nere a 96 pozzetti con fondo trasparente. Dopo la coltura O/N, al momento della trasfe>NOTA: 60 μl di terreno contenente cellule HeLa completamente sospese vengono seminati direttamente in ciascun pozzetto. Non aggiungere ulteriore terreno o piastra di roccia avanti e indietro dopo la semina, altrimenti le cellule potrebbero essere distribuite in modo non uniforme.
- Inserire le cellule HeLa con 0,05-0,1 μg di plasmide NLS-luciferasi-GFP/pRK5 in ciascun pozzetto utilizzando il reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore. Preparare una miscela di trasfezione master contenente DNA e reagente di trasfezione e aliquotarla per ogni pozzetto. Tre pozzetti con cellule non sono trasfettati con DNA, che funge da controllo per il segnale di fluorescenza di fondo per ogni condizione di trattamento.
nota: Un modo alternativo per ridurre la variazione di trasfezione è quello di trasfettare le cellule prima della semina. Tuttavia, un'ampia porzione di cellule trasfettate con proteine mal ripiegate non riesce ad attaccarsi o mostra una ridotta vitalità utilizzando questo metodo. È probabile che alcune cellule non sopportino lo stress causato dalla digestione della tripsina quando esprimono proteine tossiche mal ripiegate. Di conseguenza, il segnale fluorescente complessivo è significativamente ridotto.
- 20-24 ore dopo la trasfezione, esaminare le cellule vive al microscopio a fluorescenza invertita per l'espressione di GFP con lunghezza d'onda di eccitazione 450-490 nm.
- Rimuovere il fluido mediante aspirazione a vuoto. Aggiungere circa 200 μl di 1x PBS a ciascun pozzetto e quindi aspirarlo per rimuovere la quantità residua di terreno DMEM.
- Aggiungere 60 μl di terreno DMEM a bassa fluorescenza con il 5% di FBS e 50 μg/ml di CHX. Per esaminare la degradazione del proteasoma, includere un ulteriore inibitore del proteasoma MG132 (10 μM) in una serie di campioni. Impostare in triplice copia i pozzetti per ogni trattamento/condizione.
nota: Il trattamento con MG132 è incluso come controllo per la degradazione del proteasoma perché è fondamentale escludere altri fattori che possono causare un calo del segnale di fluorescenza, tra cui la morte cellulare e l'estinzione della fluorescenza.
- Misurare immediatamente il segnale di fluorescenza della GFP su un lettore di piastre fluorescenti dopo aver aggiunto CHX.
nota: Le impostazioni di misurazione del software sono mostrate nella Tabella 1.
- Leggere la targhetta ogni ora per un massimo di 8-10 ore. Dopo la lettura, rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari.
- Esporta i dati come file di foglio di calcolo. Utilizzare il valore medio delle letture multiple per ciascun pozzetto come l'intensità della fluorescenza. Normalizzare i valori di ciascun punto dati in base ai valori medi dell'ora 0 nei rispettivi gruppi. Tracciare l'intensità della fluorescenza normalizzata nel tempo, come mostrato nella Figura 1A e 1B e nella Figura 2, pannelli a destra.
- Esegui analisi statistiche dei tassi di degradazione tra due condizioni utilizzando l'ANOVA bidirezionale con misure ripetute.
nota: In questa analisi, "l'intensità della fluorescenza" è la variabile dipendente, mentre le "condizioni di trattamento" e il "tempo" sono i due fattori. Invece di confrontare i dati in singoli punti temporali, l'ANOVA bidirezionale con misure ripetute analizza la differenza tra i due gruppi di trattamento durante l'intero corso del tempo.
Tabella 1: Impostazioni di misurazione sul lettore di micropiastre a fluorescenza.
| File di definizione della piastra | GRE96fb |
| Modalità di misurazione | Intensità di fluorescenza Bottom |
| Lunghezza d'onda | Lunghezza d'onda di eccitazione | 485 nm |
| Larghezza di banda di eccitazione | 9 nm |
| Lunghezza d'onda di emissione | 535 nm |
| Larghezza di banda di emissione | 20 nm |
| Numero di flash | 5 |
| Guadagno | Manuale 200 |
| Tempo di integrazione | 20 μs |
| Letture multiple per pozzo | digitare | Cerchio (pieno) |
| grandezza | 5×5 |
| confine | 400 μm |
