Saggio Bioreporter: una tecnica sensibile che utilizza un sistema reporter bioluminescente per rilevare gli anticorpi SARS-CoV-2

Abstract

Fonte: Rezaei, R. et al., Rilevamento dell'anticorpo del dominio legante il recettore SARS-CoV-2 utilizzando un bioreporter basato su HiBiT. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, mostriamo il test basato sul sistema HiBit-RBD bioreporter per rilevare gli anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2. Questo sistema prende di mira il dominio RBD virale utilizzando un sistema reporter bioluminescente contenente HiBiT fuso al dominio RBD.

Protocollo

1. Rilevamento degli anticorpi anti-RBD con un test rapido e sensibile

1. Test di rilevamento degli anticorpi HiBiT-RBD
   1. Preparare il bioreporter HiBiT-RBD.
      nota: Si consiglia di utilizzare il surnatante per il test successivo in quanto è più semplice da raccogliere e contiene la versione glicosilata matura della proteina. Inoltre, il lisato contiene diverse altre proteine che potrebbero interferire con l'interazione HiBiT-RBD-anticorpo.
   2. Combinare 50 μl di surnatante contenente HiBiT-RBD con 1 μg di anticorpo SARS-CoV-2-RBD commerciale in una microprovetta da 1,5 mL. Aggiungere 20 μL di proteina legante le immunoglobuline (proteina G) alla soluzione. Portare il volume totale a 300 μl aggiungendo PBS.
      nota: Il volume totale della miscela può essere ridotto a 150 μl. Si sconsiglia di ridurre i volumi totali in quanto potrebbero comportare una miscelazione inadeguata degli anticorpi con il bioreporter.
   3. Incubare la/e provetta o le provette su un agitatore per provette o un rotatore per 30 minuti. Centrifugare a 12.000 x g per 30 s, scartare il surnatante e lavare con PBS. Ripetere il processo tre volte per rimuovere l'HiBiT-RBD libero. Risospendere in 50 μl di PBS e trasferire in una piastra a 96 pozzetti.
   4. Aggiungere 50 μL di 1x LgBiT e attendere 5 minuti. Quindi, aggiungere 50 μl di substrato 1x NanoLuc. Leggere immediatamente il segnale luminescente con un luminometro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Rondella magnetica portatile Bio-Plex	Bio-Rad	171020100	dispositivo
Sistema di dosaggio della luciferasi Dual-Glo	Promega	E2940	Kit da 100 ml
LgBiT	Promega	N3030	Kit di test
Perline magnetiche Pierce Protein G	Thermo Fisher Scientifico	Codice 88848	Saggio
Anticorpo neutralizzante spike SARS-CoV-2 (2019-nCoV), Mab di topo	SinoBiologico	40592-MM57	Saggio
Lettore di micropiastre Synergy Mx	BioTek		Luminometro lettore di piastre a 96 pozzetti