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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
Nella Figura 1 viene fornita una panoramica schematica del protocollo di analisi.
1. Preparazione iniziale
- Per la valutazione negli ovini: raccogliere il sangue in 8 mL di provette per l'attivatore del coagulo del separatore di siero (vedere la Tabella dei materiali), lasciare il campione di sangue a temperatura ambiente (RT) per 20-30 minuti e successivamente centrifugare a 2.100 x g per 15 minuti. Il surnatante chiaro che si forma nella parte superiore dei tubi è il siero. Aliquotare la fase acquosa limpida in provette per microcentrifuga e conservarla a -80 °C.
nota: Il siero a -80 °C rimane stabile per ~5 anni. Il sangue è stato raccolto dalla vena carotide utilizzando un ago da 16 G (taglio della punta) e una siringa da animali coscienti.
- Riscaldare il siero fetale bovino inattivato (FBS) mettendolo a bagnomaria a 56 °C per 30 minuti e agitare ad intermittenza. Per una maggiore precisione, posizionare un termometro in una seconda bottiglia contenente un volume equivalente di acqua e aggiungerlo al bagno di calore contemporaneamente alla bottiglia FBS. Iniziare la cronometraggio quando il termometro raggiunge i 56 °C.
- Utilizzare un'adeguata tecnica asettica e la pratica della coltura cellulare per tutte le fasi successive eseguite nella cappa di coltura cellulare. Spruzzare etanolo al 70% su tutti gli oggetti e sulla cappa prima dell'uso e pulire con ipoclorito di sodio all'1% al termine.
- Completa il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco combinando un alto contenuto di glucosio (4,5 g/L), DMEM (89%) con FBS inattivato termicamente (10%) e penicillina streptomicina (1%). Combinare e filtrare utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto sterile (dimensione dei pori di 0,22 μm, membrana in polietersulfone) (vedere la tabella dei materiali). Conservare il DMEM completo avvolto in un foglio a 4 °C.
- Stabilire le celle HT1080 (vedi Tabella dei Materiali) e il passaggio in un pallone quadrato da 75 cm2. Crea più scorte di celle congelate. Non utilizzare le cellule dopo 20 passaggi, poiché un ulteriore passaggio può influenzare i risultati del saggio.
2. Giorno 1 - Placcatura delle cellule
- Passaggio delle celle HT1080 quando raggiungono la confluenza ~80%.
- Preriscaldare il DMEM completo (preparato al punto 1.4), lo 0,05% di tripsina-EDTA e 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 37 °C a bagnomaria. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule passate utilizzando un sistema di aspirazione.
nota: Tutte le aspirazioni in questo protocollo utilizzano un sistema a vuoto con un tubo collegato a una pipetta sierologica sterile da 5 mL.
- Lavare le cellule in 10 mL di 1x PBS preriscaldato (37 °C) e tripsinizzare le cellule per 3-4 minuti in 4 mL di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,05% per staccare le cellule dal pallone.
- Inattivare la tripsina aggiungendo 6 mL di DMEM completo preriscaldato e pipettare le cellule in una provetta da 50 mL. Calcolare il numero e la concentrazione di cellule vitali utilizzando un emocitometro e il metodo di esclusione del blu di tripano.
- Diluire le cellule a una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL in DMEM completo preriscaldato. Seminare 100 μL di cellule/pozzetto in piastre trasparenti a fondo piatto a 96 pozzetti (1 x 10,4 celle per pozzetto). Incubare la piastra a 37 °C, 5% di anidride carbonica (CO2) per una notte per 16-22 ore.
3. Giorno 2 - Infettare le cellule
- Rimuovere la/e piastra/e dall'incubatrice e utilizzare un microscopio ottico per confermare che le cellule siano uniformemente disperse all'interno dei pozzetti e che la confluenza sia ~50%. Se le cellule non rientrano in un intervallo di confluenza del 45%-55%, ripetere il protocollo "Giorno 1" e regolare di conseguenza la concentrazione iniziale delle cellule.
- Generare diluizioni seriali dei campioni di siero di interesse in provette per microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando DMEM completo preriscaldato come diluente. La Tabella 1 mostra la generazione di una cascata di diluizione per campioni triplicati.
- Per eseguire il test in triplicato, preparare un 7,5 x106 genomi vettoriali (vg)/μL di soluzione di lavoro di AAV6-hPLAP (vedi Tabella dei materiali) diluendo una soluzione madre virale in 1x PBS.
- Aggiungere 66 μl della soluzione di lavoro del virus 7,5 x 106 vg/μl a ciascuna provetta contenente 264 μl di diluizione siero/terreno (330 μl di volume totale/diluizione, vedere la Tabella 1).
nota: Si tratta di un test robusto che non richiede condizioni di coltura perfette. Tuttavia, per quantificare con precisione e garantire l'affidabilità di ogni analisi, è necessario includere quanto segue: (1) un controllo solo per virus e solo terreni, (2) un controllo solo per terreni e (3) un campione di controllo positivo per NAb su tutte le piastre nelle stesse condizioni sperimentali. Il volume descritto (330 μL) rappresenta campioni triplicati + 10% della miscela di siero e virus. L'esecuzione di repliche è altamente raccomandata per la determinazione accurata dell'attività neutralizzante.
- Miscelare le diluizioni virus/siero mediante pipettaggio e posizionare le provette contenenti le miscele virus/siero in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 30 minuti per consentire la potenziale neutralizzazione.
- Pipettare 100 μl della miscela virus/siero in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente 1 x 104 cellule/pozzetto per ogni diluizione.
nota: Ciò genererà una concentrazione virale finale di 15k virus/multiplicità cellulare di infezione (MOI) in ciascun pozzetto. La Tabella 2 fornisce un esempio di layout della piastra del campione a 96 pozzetti per la valutazione dei campioni con una diluizione di 1/512.
- Avvolgere la piastra a 96 pozzetti contenente cellule, siero e AAV-hPLAP in un foglio e metterla in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 durante la notte per 16-24 ore per consentire l'ingresso di AAV nelle cellule.
4. Giorno 3 - Fissaggio e aggiunta del substrato alle cellule
- Preriscaldare un'aliquota di 1x PBS a 37 °C (~25 mL/piastra a 96 pozzetti). Raffreddare aliquote separate di PBS (piastra da ~25 mL/96 pozzetti) e H2O a doppia distillazione (DDW, piastra da ~25 mL/96 pozzetti) a 4 °C. Sciogliere un pellet di BCIP/NBT (vedere la Tabella dei materiali) in 10 mL di DDW in una provetta da centrifuga conica da 50 mL mediante vortex (10 mL sono sufficienti per 2 piastre da 96 pozzetti).
- Aspirare il terreno dai pozzetti della piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta sierologica o simile collegata a un sistema di aspirazione basato sull'aspirazione o a una cappa aspirante. Posizionare delicatamente la punta della pipetta sierologica nel pozzetto e rimuovere il terreno facendo attenzione a non danneggiare le cellule aderenti.
- Aggiungere 50 μl di RT 4% PFA a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta. Avvolgere la piastra in un foglio e lasciarla a RT per 10 minuti per fissare le celle.
cautela: La paraformaldeide (PFA) è un probabile cancerogeno ed è tossica per contatto con la pelle o gli occhi o per inalazione. Maneggiare in una cappa aspirante con adeguati dispositivi di protezione individuale e una maschera facciale. Preparare il 4% di PFA fresco diluito in PBS (~7 mL necessari per piastra a 96 pozzetti).
- Lavare e aspirare le cellule con 200 μL di RT 1x PBS. Ripetere questo passaggio due volte.
nota: Una pipetta multicanale è un'opzione efficiente per le fasi di pipettaggio.
- Pipettare 200 μl di PBS preriscaldato in ciascun pozzetto, avvolgere la piastra in un foglio e incubare a 65 °C per 90 minuti per denaturare l'attività endogena della fosfatasi alcalina.
- Aspirare i pozzetti e lavare le celle con 200 μL di PBS freddo (4 °C). Aspirare nuovamente, lavare con 200 μl di DDW freddo e aspirare nuovamente.
- Pipettare 50 μl di BCIP/NBT disciolto (preparato al punto 4.1) in ciascun pozzetto.
- Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e incubare a RT per 2-24 h.
nota: Essere coerenti con il tempo di incubazione tra le corse; La flessibilità dell'orario consente agli utenti di fotografare i pozzi il giorno 3 o il giorno successivo.
- Utilizzando una fotocamera per microscopio ottico, è possibile scattare foto di ciascun pozzetto utilizzando un obiettivo 4x, garantendo che l'esposizione, il bilanciamento del bianco e le impostazioni di luce siano utilizzati in modo uniforme per tutti i saggi eseguiti.
- Posiziona ogni pozzetto in modo identico e assicurati che i bordi del pozzetto non siano visibili nelle foto. Salva le foto in formato TIF o simile.
nota: Le impostazioni specifiche variano da un microscopio all'altro, ma la quantificazione sarà più efficace se l'illuminazione di fondo è elevata e costante in tutti i pozzetti (Figura 1B).
Tabella 1: Volumi di siero e diluente necessari per generare diluizioni seriali di siero in triplicato.
| Etichetta a cascata di diluizione | diluizione | 3 x campione (240 μL) + 10% di volume tampone (24 μL) | Rapporto siero:media |
| Diluizione 1 (D1) | 1/2 | 264 μL di siero 264 μL di terreno | 50:50 |
| Diluizione 2 (D2) | 1/4 | 264 μL D1 + 264 μL di terreno | Ore 25:75 |
| Diluizione 3 (D3) | 1/8 | 264 μL D2 +264μL terreni | 12.5:87.5 |
| Diluizione 4 (D4) | 1/16 | 264 μL D3 +264 μL terreno | 6.25:93.75 |
| Diluizione 5 (D5) | 1/32 | 264 μL D4 +264 μL di terreno | 3.13:96.87 |
| Diluizione 6 (D6) | 1/64 | 264 μL D5 +264 μL di terreno | 1.56:98.44 |
| Diluizione 7 (D7) | 1/128 | 264 μL D5 +264 μL di terreno | 0.78:99.22 |
| Diluizione 8 (D8) | 1/256 | 264 μL D5 +264 μL di terreno | 0.39:99.61 |
| Diluizione 9 (D9) | 1/512 | 264 μL D7 + 264 μL di terreno | 0.2:99.8 |
| Diluizione 10 (D10) | 1/2048 | 132 μl D8 + 396 μl di terreno | 0.05:99.95 |
| Diluizione 11 (D11) | 1/8192 | 132 μL D9 + 396 μL di terreno | 0.01:99.99 |
| Diluizione 12 (D12) | Codice 1/32768 | 132 μL D10 + 396 μL di terreno | 0,003:99,997 |
Tabella 2: Esempio di layout della piastra a 96 pozzetti per la valutazione di campioni di siero naïve in diluizioni che vanno da 1/2 a 1/512. Diluizioni più elevate sono incorporate nel test se si valuta un campione noto per essere positivo per AAV NAbs (campioni post-somministrazione) o se è richiesto un titolo più elevato. MO (-C): Controllo solo multimediale. VO (+C): controllo solo di virus e contenuti multimediali. mAb: Anticorpo monoclonale contro AAV (controllo NAb positivo).
| Campione di siero #1 | Campione di siero #2 | Campione di siero #3 | Mono AB (mAB), controlli e campioni extra |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 50 ng
Mab | 50 ng
Mab | 50 ng
Mab |
| B | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 5 ng
Mab | 5 ng
Mab | 5 ng
Mab |
| C | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 0.5 ng
Mab | 0.5 ng
Mab | 0.5 ng
Mab |
| D | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | MO (-C) | MO (-C) | MO (-C) |
| E | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | VO (+C) | VO (+C) | VO (+C) |
| F | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | Campione
#1
1/512 | Campione
#1
1/512 | Campione
#1
1/512 |
| G | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | Campione
#2
1/512 | Campione
#2
1/512 | Campione
#2
1/512 |
| H | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | Campione
#3
1/512 | Campione
#3
1/512 | Campione
>#3
1/512 |
