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1. Preparazione del terreno di crescita, della soluzione di ofloxacina e delle scorte cellulari di E. coli
- Terreno Luria-Bertani (LB) regolare: aggiungere 10 g/L di triptone, 10 g/L di cloruro di sodio (NaCl) e 5 g/L di estratto di lievito in acqua deionizzata (DI). Sterilizzare il terreno mediante sterilizzazione in autoclave.
- Piastre di agar LB: aggiungere 10 g/L di triptone, 10 g/L di NaCl, 5 g/L di estratto di lievito e 15 g/L di agar in acqua deionizzata e sterilizzare il terreno mediante sterilizzazione in autoclave. Alla temperatura desiderata (~55 °C), versare ~30 mL di terreno di agar in piastre quadrate (10 x 10 cm). Asciugare le piastre e conservarle a 4 °C.
- Terreno LB modificato: Aggiungere 10 g/L di triptone e 5 g/L di estratto di lievito in acqua deionizzata. Sterilizzare il terreno mediante sterilizzazione in autoclave.
- Terreno LB modificato, compreso un osmolita: Miscelare 2 terreni LB modificati con una soluzione di osmolita 2x in volumi uguali. Per preparare 2 LB modificati di terreno, aggiungere 20 g/L di triptone e 10 g/L di estratto di lievito in acqua deionizzata e sterilizzare in autoclave. Per preparare la soluzione di osmolita 2x, sciogliere l'osmolita di interesse (quantità 2x) in acqua deionizzata, quindi sterilizzare la soluzione con filtro.
nota: L'osmolita di interesse e le sue concentrazioni possono essere determinati dai saggi di screening Phenotype Microarray (vedi Protocollo 4). Tuttavia, l'osmolita testato e la concentrazione 2x associata possono essere regolati a seconda della natura della ricerca. Ad esempio, per studiare l'impatto di 1 mM di cloruro di sodio, una soluzione di osmolita 2x sarebbe una soluzione di cloruro di sodio 2 mM.
- Soluzione madre di ofloxacina (5 mg/mL): aggiungere 5 mg di sale di ofloxacina (OFX) in 1 mL di acqua deionizzata. Aggiungere 10 μl di idrossido di sodio 10 M per aumentare la solubilità di OFX in acqua, quindi sterilizzare la soluzione con filtro. Preparare le aliquote e conservare a -20 °C.
nota: L'ofloxacina è un antibiotico chinolonico che è stato ampiamente utilizzato sia per le cellule batteriche in crescita che per quelle non in crescita14,21. La concentrazione inibitoria minima (MIC) di OFX per le cellule MG1655 di E. coli è compresa tra 0,039 e 0,078 μg/mL. Inoltre, si noti che altri antibiotici come l'ampicillina e la kanamicina sono comunemente usati nella ricerca sui persistenti. La scelta degli antibiotici dipende dalla natura dello studio.
- Stock cellulari di E. coli MG1655: Inoculare 2 mL di terreno LB normale con una singola colonia in una provetta da 14 mL (con tappo a scatto) e coltivare le cellule in un agitatore orbitale a 250 giri/min e 37 °C. Quando le cellule raggiungono la fase stazionaria, mescolare 500 μL di coltura cellulare con 500 μL di glicerolo al 50% (sterile) in una fiala criogenica e conservare a -80 °C.
2. Propagazione delle celle per eliminare i persistenti preesistenti
- Per preparare una coltura notturna, prelevare una piccola quantità di cellule da una riserva di cellule congelate con una punta di pipetta sterile (non scongelare la parte di cellule di glicerolo) e inoculare le cellule in 2 ml di terreno LB modificato in una provetta da 14 ml con tappo a scatto. Coltura delle cellule in un agitatore orbitale a 250 giri/min e 37 °C per 12 ore.
- Prima propagazione
- Dopo 12 ore, trasferire 250 μL di coltura notturna in 25 mL di terreno LB modificato fresco in un pallone deflettore da 250 mL coperto con un foglio di alluminio sterile.
- Far crescere la coltura cellulare in un agitatore orbitale a 250 giri/min e 37 °C fino a quando le cellule raggiungono la fase esponenziale media (OD600 = 0,5).
- Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) utilizzando un lettore di micropiastre ogni 30 minuti.
- Seconda propagazione
- A OD600 = 0,5, diluire 250 μL di coltura cellulare dal primo pallone in 25 mL di terreno LB modificato fresco in un pallone da 250 mL con deflettore.
- Coltivare la seconda coltura cellulare in un agitatore orbitale a 250 giri/min e 37 °C fino a OD600=0,5.
- Misurare la densità ottica ogni 30 min.
nota: Una coltura notturna può avere una quantità significativa di cellule persistenti. Il metodo del ciclo di diluizione/crescita descritto sopra può essere utilizzato per eliminare questi persistenti preesistenti prima di trasferire le cellule in microarray. La loro eliminazione può essere convalidata quantificando i livelli di persistenza delle colture notturne con il saggio descritto nel Protocollo 3.
3. Convalidare l'eliminazione di cellule persistenti preesistenti
- Dopo la seconda propagazione (cfr. punto 2.3), diluire 250 μL di coltura cellulare (OD600 = 0,5) in 25 mL di terreno LB modificato fresco in un pallone da 250 mL con deflettore.
nota: Per i controlli, diluire 250 μl di coltura notturna (vedere fase 2.1) in 25 mL di terreno LB modificato fresco in un pallone da 250 mL con deflettore. Prima di trasferire le cellule nel pallone, la densità cellulare della coltura notturna deve essere regolata in un terreno LB fresco modificato per ottenere OD600 = 0,5.
- Aggiungere 25 μl di soluzione madre OFX (5 mg/mL) nella sospensione cellulare e agitare delicatamente il pallone per rendere omogenea la coltura del saggio. La concentrazione finale di OFX è di 5 μg/mL nella coltura del saggio.
- Incubare la coltura del saggio in un agitatore orbitale a 250 giri/min e 37 °C.
- Ad ogni ora durante il trattamento (compreso 0 h, il punto temporale prima dell'aggiunta di OFX alla coltura del saggio), trasferire 1 mL della coltura del saggio dal pallone a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
- Centrifugare la coltura del saggio nella provetta da microcentrifuga a 17.000 x g per 3 minuti.
- Rimuovere con cautela 950 μl di surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Aggiungere 950 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nella provetta per microcentrifuga.
- Ripetere le fasi di lavaggio 3,5-3,7 per 3 volte in totale fino a quando la concentrazione di antibiotico non scende al di sotto della concentrazione inibitoria minima (MIC).
- Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet cellulare in 100 μl di soluzione di PBS, ottenendo un campione concentrato 10x.
- Prelevare 10 μl della sospensione cellulare e diluirla in serie sei volte in 90 μl di soluzione PBS utilizzando una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti.
- Individuare 10 μl di sospensioni cellulari diluite su piastre di agar fresche prive di antibiotici. Per aumentare il limite di rilevamento, preparare i restanti 90 μl di sospensione cellulare su una piastra di agar fresca.
- Incubare le piastre di agar a 37 °C per 16 ore, quindi contare le unità formanti colonie (CFU). Tenere conto dei tassi di diluizione durante il calcolo del numero totale di CFU in 1 mL di coltura del saggio. Le curve di uccisione sono generate tracciando i valori logaritmici di CFU rispetto alla durata del trattamento antibiotico.
nota: Un trattamento OFX di 6 ore è sufficiente per ottenere una curva di uccisione bifasica per le cellule di E. coli. Il livello di persistenza delle cellule propagate (misurato dalla conta delle CFU a 6 ore) deve essere significativamente inferiore a quello della coltura notturna. Le procedure descritte nei Protocolli 2 e 3 possono essere eseguite con LB regolare a seconda del disegno di ricerca.
4. Screening di piastre per microarray
- Preparazione di colture cellulari con microarray
- Trasferire 250 μl di cellule in fase esponenziale a 25 mL di terreno LB modificato fresco in una provetta da centrifuga da 50 mL. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea.
nota: Le celle in fase esponenziale (OD600 = 0,5) sono ottenute dalla seconda fase di propagazione (vedi passaggio 2.3).
- Trasferire la sospensione cellulare diluita in un serbatoio sterile da 50 mL.
- Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 150 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di un microarray, ovvero una piastra da 96 pozzetti contenente vari osmoliti.
nota: I pozzetti che non hanno osmoliti fungono da controlli.
- Coprire il microarray con una membrana sigillante permeabile ai gas.
- Incubare la piastra in un agitatore orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 24 h.
nota: In questi esperimenti sono state utilizzate piastre disponibili in commercio, come i Phenotype Microarrays (PM-9 e PM-10) che includono un'ampia gamma di osmoliti, tamponi pH e altre sostanze chimiche allo stato essiccato a varie concentrazioni. Questi microarray sono in formati di piastre a 96 pozzetti a mezza area. I volumi di coltura devono essere regolati in base al tipo di piastre utilizzate. I microarray possono anche essere generati manualmente.
- Preparazione manuale di piastre per microarray
- Trasferire 75 μL di 2 soluzioni osmolitiche nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti a mezza area.
- Trasferire 500 μl di cellule in fase esponenziale a 25 mL di terreno LB modificato 2x in una provetta da centrifuga da 50 mL. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea.
nota: Il tasso di inoculazione è stato aggiustato per essere coerente con il protocollo di screening dei microarray descritto al punto 4.1.
- Aggiungere 75 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti a semiarea contenente 2 soluzioni osmolitiche.
- Incubare la piastra in un agitatore orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 24 ore.
- Preparazione delle piastre per saggi persistenti
- Preparare 25 mL di terreno LB modificato contenente 5 μg/mL di OFX in una provetta da centrifuga da 50 mL e trasferire questo terreno in un serbatoio sterile.
- Trasferire 190 μl di terreno LB modificato con OFX dal serbatoio in ciascun pozzetto di una generica piastra a fondo piatto da 96 pozzetti (piastra per il saggio persistente) utilizzando una pipetta multicanale.
- Rimuovere il microarray dall'agitatore (dopo aver coltivato per 24 ore) e trasferire 10 μL di colture cellulari dal microarray ai pozzetti della piastra del saggio persistenter, contenente terreno LB modificato con OFX.
- Prelevare 10 μl di sospensioni cellulari dalla piastra del saggio persistenter e diluire in serie tre volte in 290 μl di soluzione PBS utilizzando una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti e una pipetta multicanale.
- Dopo la diluizione seriale, posizionare 10 μl di tutte le sospensioni cellulari diluite in serie su piastre di agar fresche prive di antibiotici utilizzando una pipetta multicanale.
- Incubare la piastra per il saggio persistente (preparata al punto 4.3.3) in un agitatore orbitale a 37 °C e 250 giri/min per 6 ore dopo aver coperto la piastra con una membrana di tenuta permeabile ai gas.
- Dopo 6 ore di incubazione in agitatore, estrarre la piastra del saggio persistente e ripetere i passaggi 4.3.4-4.3.5.
- Incubare le piastre di agar per 16 ore a 37 °C, quindi contare le CFU. I livelli di CFU prima e 6 ore dopo il trattamento antibiotico consentono di calcolare la frazione persistente in ciascun pozzetto. I conteggi dei CFU prima del trattamento con OFX aiutano anche a valutare gli effetti degli osmoliti e sulla vitalità di E. coli.