1. Misurazione del declino della proteostasi nel tessuto muscolare utilizzando animali che esprimono poliglutammina
NOTA: Due metodi possono essere utilizzati per identificare il declino della proteostasi nelle cellule muscolari: l'imaging della formazione di aggregati proteici durante l'invecchiamento (1.1) e la misurazione della proteotossicità che questi aggregati causano con l'età attraverso l'insorgenza della paralisi (1.2).
- Imaging della formazione di aggregati di poliglutammina nel muscolo durante l'invecchiamento
nota: La progressione età-dipendente dell'aggregazione proteica nelle cellule muscolari viene visualizzata utilizzando ripetizioni di poliglutammina (polyQ) fuse a una proteina fluorescente gialla (YFP). Questo protocollo delinea l'uso del ceppo AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], ma possono essere utilizzati anche altri ceppi varianti di poliglutammina. Il transgene polyQ::YFP è espresso nel muscolo utilizzando il promotore muscolo-specifico unc-54. Gli animali sincronizzati che esprimono unc-54p::p olyQ::YFP vengono visualizzati al giorno 1, 2, 3 e 4 dell'età adulta. Per visualizzare gli aggregati unc-54p::p olyQ::YFP, utilizzare un microscopio composto attrezzato per la fluorescenza o un microscopio da dissezione fluorescente. AM140 è disponibile presso il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) all'indirizzo: https://cgc.umn.edu/strain/AM140
- Nei giorni di imaging (giorno 1, 2, 3 e 4 dell'età adulta), prelevare 20 animali e montarli su un vetrino da microscopio con un tampone di agarosio al 3% e una goccia di 5 μl di azoturo di sodio da 10 mM (diluito in tampone M9).
- Dopo che tutti gli animali sono stati immobilizzati con azoturo di sodio (~ 5 minuti), fotografare l'intero corpo degli animali utilizzando una lente di ingrandimento 10x (Figura 1A). Per l'imaging, utilizzare un filtro FITC e la stessa esposizione per ogni animale. Eliminare i vetrini dopo l'imaging.
nota: In alternativa, i focolai YFP possono anche essere quantificati direttamente sulle piastre, ma il movimento deve essere inibito applicando un flusso di anidride carbonica sulla piastra durante il punteggio. Questo metodo alternativo è più appropriato quando si esegue lo screening di un gran numero di condizioni.
- Dopo l'acquisizione delle immagini, contare il numero di focolai nei muscoli della parete corporea dell'intero animale. I fuochi sono segnali punteggiati più luminosi che possono essere differenziati dal segnale solubile in dimmer sullo sfondo.
- Traccia la progressione dell'accumulo di focolai YFP dai giorni 1, 2, 3 e 4. Tracciate un grafico XY dove X rappresenta i giorni dell'età adulta e Y rappresenta il numero di focolai unc-54p::p olyQ::YFP (Figura 1B). Il numero di focolai nella condizione sperimentale (ad esempio, sottoregolazione o sovraespressione genica) viene confrontato con gli animali di controllo. Eseguire analisi statistiche tra i gruppi in ogni punto temporale osservato per ogni prova.
- Quando si confronta il conteggio dei focolai per due sole condizioni, eseguire un test t campione indipendente in ogni punto temporale.
- Quando si confrontano i conteggi dei punti focali per più di due condizioni, eseguire un'analisi ANOVA omnibus unidirezionale per ogni punto temporale, inclusi i dati per tutte le condizioni in quel punto temporale. Se l'ANOVA omnibus produce un valore p significativo (cioè p < 0,005), eseguire un'analisi post-hoc con test t a campione indipendenti a coppie per determinare le condizioni specifiche tra le quali è stata rilevata una differenza significativa nei focolai (ad esempio, per i gruppi A, B e C confrontare A & B, A & C e B & C).
2. Misurazione dei tassi di paralisi animale come surrogato della tossicità della poliglutammina nelle cellule muscolari
NOTA: L'aumento dipendente dall'età degli aggregati polyQ nel muscolo provoca il declino della funzione muscolare che guida la locomozione. Questo difetto di locomozione può essere determinato misurando il tasso progressivo di paralisi negli animali che esprimono polyQ. Per il test di paralisi, gli animali sincronizzati che esprimono unc-54p::p olyQ::YFP sono valutati al giorno 3, 5, 7 e 9 dell'età adulta. Aggiungere ulteriori punti temporali secondo necessità, per estendere l'intervallo di punteggio in modo tale da poter valutare l'effetto della perturbazione genetica.
- Nei giorni di punteggio (giorno 3, 5, 7 e 9 dell'età adulta), guarda le piastre di 6 cm contenenti 50 animali e registra il numero di animali paralizzati. Rimuovere gli animali paralizzati dal piatto. Se gli animali sono strisciati fuori dal piatto o sono morti, dovrebbero essere censurati; Registrare l'evento in modo che possa essere preso in considerazione nell'analisi.
nota: Un animale è considerato paralizzato quando non si osserva alcun movimento dopo averlo esposto a stimoli tattili leggeri o delicati. L'attività di pompaggio faringeo viene utilizzata per determinare se gli animali immobili sono vivi o morti.
- Al termine dell'esperimento, calcolare il tasso di paralisi per ciascuna condizione. Fallo in ogni momento dividendo la frazione di animali paralizzati per il numero totale di animali osservati per quella condizione. Se si osservano più piastre per condizione per punto temporale (ad esempio, piastre replicate), calcolare il rapporto separatamente per ciascuna replica.
- Tracciare la progressione del tasso di paralisi in un grafico XY (scatterplot). X rappresenta i giorni dell'età adulta e Y rappresenta i tassi di paralisi. Il tasso di paralisi degli animali unc-54p::p olyQ::YFP è confrontato con gli animali di controllo (Figura 1C). Eseguire analisi statistiche tra i gruppi; Per più studi, trattare gli studi in modo indipendente. Usa la regressione dei rischi proporzionali di Cox e il test di Wald. La maggior parte degli strumenti di analisi dei dati che supportano l'analisi della sopravvivenza supportano anche la modellazione di Cox.
- Trasforma i dati: ogni condizione dovrebbe avere due colonne, una per il tempo e un'altra per "evento". Ad ogni punto temporale osservato, aggiungi una riga con "0" per ogni animale paralizzato e un "1" per ogni animale censurato. Il numero totale di file deve essere uguale al numero di animali di partenza sulla targa per tale condizione.
- Eseguire la modellazione dei rischi proporzionali di Cox, seguita dal test di Wald, secondo le istruzioni per il software statistico. Un modello univariato sarà appropriato per i tipici disegni di esperimenti. Per più di due condizioni, se un test con tutte le condizioni incluse indica un risultato significativo (ad esempio, p < 0,005), è possibile eseguire test a coppie tra le condizioni per determinare la specifica coppia significativa di condizioni.
nota: Il modello di Cox si basa sul presupposto che le condizioni di test modulano la probabilità di un evento in modo proporzionale nel tempo. Ciò significa, ad esempio, che il modello di Cox non sarebbe appropriato per confrontare una condizione in cui la maggior parte degli animali è paralizzata al giorno 1 con una condizione in cui la maggior parte degli animali è paralizzata al giorno 9. Estensioni del modello di Cox e altri approcci per confrontare le proporzioni paralizzate in ogni punto temporale, sono disponibili per i casi in cui l'ipotesi degli hazard proporzionali non regge.
