Saggio di co-incubazione batterica: una tecnica basata sulla microscopia a fluorescenza per visualizzare la competizione batterica intraspecifica a livello di singola cellula

Abstract

Fonte: Smith, S., et al., Quantificazione della competizione interbatterica utilizzando l'imaging a fluorescenza a cellula singola. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video dimostra un metodo basato sulla microscopia a fluorescenza per studiare la competizione batterica a livello di singola cellula. Questo metodo fornisce informazioni sulla struttura e la funzione delle comunità batteriche.

Protocollo

1. Coincubare ceppi batterici

1. Scegli due ceppi batterici per i saggi di competizione batterica a cellula singola. Qui, vengono utilizzati due ceppi di V. fischeri: un ceppo bersaglio (ES11424) e un ceppo inibitore (MJ1125) che è noto per uccidere il ceppo bersaglio utilizzando il sistema di secrezione di tipo VI sul cromosoma II (T6SS2)1, che è un meccanismo di uccisione dipendente dal contatto.
2. Trasforma i ceppi con plasmidi stabili che codificano geni per diverse proteine fluorescenti (ad esempio, GFP o RFP) per distinguere visivamente i tipi di ceppo al microscopio. Qui, il ceppo inibitore è marcato con un plasmide codificante GFP (pVSV102) e il ceppo bersaglio è marcato con un plasmide codificante dsRed (pVSV208).
3. Iniziare con colture a log intermedio per entrambi i ceppi, misurare e registrare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) per tutti i campioni.
4. Normalizzare ogni campione a un OD₆₀₀ = 1,0, che corrisponde a circa 10⁹ CFU/mL per V. fischeri, diluendo la coltura con terreno LBS.
5. Mescolare i due ceppi concorrenti con un rapporto 1:1 in base al volume aggiungendo 30 μl di ciascun ceppo normalizzato a una provetta da 1,5 mL etichettata. Vortex la coltura a ceppo misto per 1-2 s.
   nota: In alcuni casi, può essere opportuno mescolare cocolture in rapporti diversi. Ad esempio, quando una varietà cresce molto più velocemente dell'altra, potrebbe essere necessario iniziare la varietà a crescita più lenta con un vantaggio numerico per osservare la concorrenza. L'ottimizzazione può essere necessaria anche se OD₆₀₀ non corrisponde a CFU/mL simili per entrambi i ceppi.
6. Ripetere il passaggio 1.5 per ogni replica biologica e trattamento. Nell'esempio mostrato qui, ciò si tradurrà in un totale di quattro provette a ceppo misto: due repliche biologiche con il ceppo inibitore wild-type mescolato con il ceppo bersaglio e due repliche biologiche con il ceppo mutante del sistema di secrezione di tipo VI mescolato con il ceppo bersaglio.
7. Per garantire che le cellule concorrenti siano sufficientemente dense per l'uccisione dipendente dal contatto nella coincubazione sul tampone di agar, concentrare ogni coltura mista 3 volte centrifugando la coltura mista in una provetta da centrifuga standard da 1,5 ml per 1 minuto a 21.130 x g, scartando il surnatante e risospendendo ogni pellet in un terreno da 20 μL LBS. Ripetere per ogni campione.
   nota: Alcune cellule batteriche sono sensibili ai danni da centrifugazione ad alto rcf; In questi casi, la coltura mista può essere centrifugata per 3 minuti a 4600 x g. Inoltre, quando si quantifica la competizione dipendente dal contatto, è importante garantire una densità cellulare sufficiente sul vetrino per osservare l'uccisione. In questo articolo, i trattamenti "affollati", dove si osserva l'uccisione, avevano circa 10 cellule/20 μm².

2. Configurazione delle diapositive

1. Quando si utilizza un microscopio verticale, posizionare un tampone di agarosio da ~5 mm^{e 2} su un vetrino standard da 1 mm. Posizionare 2 μl di una coltura mista sul tampone di agarosio e posizionare un vetrino coprioggetti #1,5 (25 mm²) sul punto. Vedere la Figura 1B.
2. Quando si utilizza un microscopio invertito, posizionare 2 μL di una coltura mista sul fondo del vetrino coprioggetti #1,5 di una piastra di Petri da 35 mm e posizionare un tampone di agarosio da ~5 mm² sul punto di coincubazione. Posizionare un vetrino coprioggetto circolare da 12 mm sul tampone di agarosio. Vedere la Figura 1C per un esempio.
3. Ripetere i passaggi 2.1 o 2.2, a seconda della configurazione del microscopio utilizzata, per le restanti tre colture miste, ottenendo quattro vetrini o piatti da visualizzare.
4. Lasciare riposare i vetrini sul piano di lavoro per circa 5 minuti prima di procedere. Ciò consente alle cellule di depositarsi sul tampone di agar ed eliminare il movimento durante il processo di imaging.

3. Microscopia a fluorescenza

1. Inizia concentrandoti sulle cellule utilizzando la luce bianca (contrasto di fase o DIC) per ridurre al minimo gli effetti del fotosbiancamento. Sulla base della dimensione media di una singola cellula batterica, utilizzare un obiettivo per olio 60x o 100x.
2. Regolare il tempo di esposizione e le impostazioni di acquisizione per ciascun canale in modo che le celle siano visibili nel canale appropriato con un rilevamento minimo dello sfondo.
   nota: È opportuno utilizzare tempi di esposizione diversi per canali diversi, ma lo stesso tempo di esposizione dovrebbe essere utilizzato per tutte le repliche biologiche e i trattamenti per un determinato canale.
3. Per ogni campione, selezionare almeno cinque campi visivi (FOV) e acquisire le immagini in ciascun canale appropriato utilizzando le impostazioni di acquisizione (vedere gli esempi nella Figura 2). Salva i punti XY da ciascun FOV in modo che lo stesso FOV possa essere ripreso durante il punto temporale finale. L'imaging dello stesso FOV in ogni punto temporale è necessario per determinare la proporzione di area occupata dalle cellule bersaglio o inibitrici durante le fasi di analisi.
   nota: In questo esempio, la fluorescenza della GFP viene rilevata utilizzando un filtro con una lunghezza d'onda di eccitazione di 467 - 498 nm e un filtro di emissione di 513 - 556 nm ed è di colore verde falso. La fluorescenza di dsRed viene rilevata utilizzando un filtro con una lunghezza d'onda di eccitazione di 542 - 582 nm e un filtro di emissione di 603 - 678 nm ed è di colore magenta falso.
4. Dopo 2 ore, ripetere il passaggio precedente per ogni campione utilizzando i punti XY precedentemente salvati (Figura 2).
   nota: Potrebbe essere necessario ottimizzare la tempistica delle immagini successive per organismi con diversi tassi di crescita o meccanismi competitivi.

Risultati

Figura 1: Preparazione del tampone di agarosio e configurazione del vetrino per i saggi di coincubazione. (A) Predisposizione per la produzione di tamponi di agarosio al 2%. Cinque strati di nastro adesivo da laboratorio (verde) sono avvolti attorno a un vetrino coprioggetto in due punti a circa 20 mm di distanza. Successivamente, l'agarosio caldo al 2% in soluzione salina tamponata ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL	pescatore	05-408-129
Pipetta monocanale da 10 uL
Pipetta monocanale da 1000 uL
Pipetta monocanale da 20 uL
Pipetta monocanale da 200 uL
agarosio	pescatore	BP165-25	Agarosio a basso punto di fusione
Cellvis Piatto da 35 mm	pescatore	NC0409658	#1.5 fondo in vetro di copertura
cloramfenicolo	sigma	Codice C0378	stock (20 mg/mL in etanolo); concentrazione finale in terreno (2 μg/mL LBS)
Software per l'analisi delle immagini FIJI	ImmagineJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Software open source
Fisherbrand Copri Occhiali: Circles	pescatore	12-545-81P	#1,5 vetro di copertura; diametro 12 mm
Kanamicina solfato	pescatore	BP906-5	stock (100 mg/mL in acqua, sterilizzazione con filtro); concentrazione finale in terreno (1 μg/mL LBS)
Carta velina per la pulizia delle lenti	pescatore	S24530
Piastre di Petri	pescatore	FB0875713	sterile con coperchio
Lamette	pescatore	S65921
Cuvette semi-micro	VWR	97000-586
spettrofotometro
Thermo Scientific Vetrini per microscopio semplici con sigillo d'oro	pescatore	12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Vetro di copertura	pescatore	Codice 22-050-235	#1.5 vetro di copertura, 25 mm2
Olio da immersione di tipo F	pescatore	NC0297589
Microscopio a fluorescenza verticale o invertito con fotocamera e software di imaging			Le immagini di questo articolo sono state acquisite su un microscopio a fluorescenza invertita Nikon TI-2 dotato di una fotocamera CMOS digitale ORCA-Fusion utilizzando il software NIS-Elements.
vortice
Bagnomaria			Utilizzato per mantenere caldo l'agarosio prima del pipettaggio
Supporti LBS
Tampone Tris 1M (pH ~7,5)			50 mL di tampone stock 1 M (62 mL di HCl, 938 mL di acqua deionizzata e.gno, 121 g di base Trizma)
Agar Tecnico	pescatore	DF0812-17-9	15 g (Aggiungere solo per piatti)
Acqua deionizzata			950 ml
cloruro di sodio	pescatore	S640-3	20 g
Triptone	pescatore	BP97265	10 g
Estratto di lievito	pescatore	BP9727-2	5 g
mPBS (PBS marino)			Soluzione salina tamponata con fosfato con aggiunta di sali marini; utilizzata per la produzione di tamponi di agarosio
10X PBS	pescatore	ICN1960454
Sale marino istantaneo dell'oceano	Oceano istantaneo	SS1-160P	Regolare la concentrazione alla salinità appropriata; 20 psu utilizzati qui
Unità filtranti sottovuoto sterili	pescatore	SCGVU01RE	Utilizzato per filtrare-sterilizzare mPBS
Pompa a vuoto			Utilizzato per filtrare-sterilizzare mPBS