Saggio di co-incubazione batterica: una tecnica basata sulla microscopia a fluorescenza per visualizzare la competizione batterica intraspecifica a livello di singola cellula

Abstract

Fonte: Smith, S., et al., Quantificazione della competizione interbatterica utilizzando l'imaging a fluorescenza a cellula singola. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video dimostra un metodo basato sulla microscopia a fluorescenza per studiare la competizione batterica a livello di singola cellula. Questo metodo fornisce informazioni sulla struttura e la funzione delle comunità batteriche.

Protocollo

1. Coincubare ceppi batterici

1. Scegli due ceppi batterici per i saggi di competizione batterica a cellula singola. Qui, vengono utilizzati due ceppi di V. fischeri: un ceppo bersaglio (ES11424) e un ceppo inibitore (MJ1125) che è noto per uccidere il ceppo bersaglio utilizzando il sistema di secrezione di tipo VI sul cromosoma II (T6SS2)1, che è un meccanismo di uccisione dipendente dal contatto.
2. Trasforma i ceppi con plasmidi stabili che codificano geni per diverse proteine fluorescenti (ad esempio, GFP o RFP) per distinguere visivamente i tipi di ceppo al microscopio. Qui, il ceppo inibitore è marcato con un plasmide codificante GFP (pV....

Risultati

Figura 1: Preparazione del tampone di agarosio e configurazione del vetrino per i saggi di coincubazione. (A) Predisposizione per la produzione di tamponi di agarosio al 2%. Cinque strati di nastro adesivo da laboratorio (verde) sono avvolti attorno a un vetrino coprioggetto in due punti a circa 20 mm di distanza. Successivamente, l'agarosio caldo al 2% in soluzione salina tamponata .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL	pescatore	05-408-129
Pipetta monocanale da 10 uL
Pipetta monocanale da 1000 uL
Pipetta monocanale da 20 uL
Pipetta monocanale da 200 uL
agarosio	pescatore	BP165-25	Agarosio a basso punto di fusione
Cellvis Piatto da 35 mm	pescatore	NC0409658	#1.5 fondo in vetro di copertura
cloramfenicolo	sigma	Codice C0378	stock (20 mg/mL in etanolo); concentrazione finale in terreno (2 μg/mL LBS)
Software per l'analisi delle immagini FIJI	ImmagineJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Software open source
Fisherbrand Copri Occhiali: Circles	pescatore	12-545-81P	#1,5 vetro di copertura; diametro 12 mm
Kanamicina solfato	pescatore	BP906-5	stock (100 mg/mL in acqua, sterilizzazione con filtro); concentrazione finale in terreno (1 μg/mL LBS)
Carta velina per la pulizia delle lenti	pescatore	S24530
Piastre di Petri	pescatore	FB0875713	sterile con coperchio
Lamette	pescatore	S65921
Cuvette semi-micro	VWR	97000-586
spettrofotometro
Thermo Scientific Vetrini per microscopio semplici con sigillo d'oro	pescatore	12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Vetro di copertura	pescatore	Codice 22-050-235	#1.5 vetro di copertura, 25 mm2
Olio da immersione di tipo F	pescatore	NC0297589
Microscopio a fluorescenza verticale o invertito con fotocamera e software di imaging			Le immagini di questo articolo sono state acquisite su un microscopio a fluorescenza invertita Nikon TI-2 dotato di una fotocamera CMOS digitale ORCA-Fusion utilizzando il software NIS-Elements.
vortice
Bagnomaria			Utilizzato per mantenere caldo l'agarosio prima del pipettaggio
Supporti LBS
Tampone Tris 1M (pH ~7,5)			50 mL di tampone stock 1 M (62 mL di HCl, 938 mL di acqua deionizzata e.gno, 121 g di base Trizma)
Agar Tecnico	pescatore	DF0812-17-9	15 g (Aggiungere solo per piatti)
Acqua deionizzata			950 ml
cloruro di sodio	pescatore	S640-3	20 g
Triptone	pescatore	BP97265	10 g
Estratto di lievito	pescatore	BP9727-2	5 g
mPBS (PBS marino)			Soluzione salina tamponata con fosfato con aggiunta di sali marini; utilizzata per la produzione di tamponi di agarosio
10X PBS	pescatore	ICN1960454
Sale marino istantaneo dell'oceano	Oceano istantaneo	SS1-160P	Regolare la concentrazione alla salinità appropriata; 20 psu utilizzati qui
Unità filtranti sottovuoto sterili	pescatore	SCGVU01RE	Utilizzato per filtrare-sterilizzare mPBS
Pompa a vuoto			Utilizzato per filtrare-sterilizzare mPBS