Saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato: un saggio di prossimità basato su perline per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni proteina-proteina

Abstract

Fonte: Wang, L. et al., Studi sulle interazioni chaperone-cochaperone utilizzando un saggio omogeneo basato su perline. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, dimostriamo il saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato, un saggio di prossimità basato su microsfere. Utilizza perline accettori e donatrici di dimensioni omogenee, immobilizzate con due proteine che tendono a interagire per schermare potenziali piccole molecole che inibiscono le interazioni proteiche.

Protocollo

NOTA: Una panoramica di questo protocollo è mostrata nella Figura 1.

1. Espressione e purificazione di GST-FKBP51 e GST-FKBP52 (Figura 1A)

1. Plasmidi
   NOTA: Ottenere cloni di cDNA per FKBP51 umano (ID clone: 5723416) e per FKBP52 umano (ID clone: 7474554) dal consorzio IMAGE.
   1. Amplificare il DNA FKBP51 umano mediante PCR con primer (avanti; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', indietro; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') contenenti sporgenze di BamHI e XhoI e clonare nel vettore pGEX6-1 nei siti di restrizione BamHI / XhoI.
   2. Amplificare il DNA FKBP52 umano mediante PCR con primer (avanti; 5'-GAATTGACAGCCGAGGAGGAGATG-3', indietro; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') contenenti sporgenze EcoRI e XhoI e clonare in vettore pGEX6-2 nei siti di restrizione EcoRI / XhoI.
      nota: L'impostazione e le condizioni della reazione PCR sono mostrate nella Tabella 1 e nella Tabella 2.
   3. Verificare la sequenza inserita e trasformare i plasmidi in E. coli chimicamente competente secondo il protocollo di produzione.
2. Espressione e purificazione delle proteine
   1. Aggiungere 25 g di base di brodo Luria (LB) in 1 L di acqua distillata per ottenere la soluzione LB. Autoclavarlo a 121 °C per 15 min. Dopo il raffreddamento, aggiungere 50 μg/mL di ampicillina.
   2. Prelevare una colonia di batteri che esprimono GST-FKBP51 o GST-FKBP52 e mescolarla con 500 μL di soluzione LB in una provetta da 1,5 mL. Vortice.
   3. Aggiungere la miscela di "1.2.2" in 1 L di soluzione LB nel pallone di Erlenmeyer coperto con un foglio di alluminio. Incubare il matraccio di Erlenmeyer nell'agitatore per una notte a 37 °C.
   4. Indurre l'espressione proteica aggiungendo 1 mM di isopropil-β-D-tiogalattoside (IPTG) al pallone di Erlenmeyer e continuare l'incubazione per altre 2 ore.
   5. Per ottenere pellet cellulari, centrifugare a 5.000 x g per 15 minuti. Rimuovere il surnatante.
      nota: I pellet di celle possono essere conservati a -20 °C.
   6. Risospendere i pellet cellulari in 40 mL di PBS e sonicare 3 x 20 s su ghiaccio. Aggiungere 1 mM di PMSF, 1 mM di EDTA e un cocktail di inibitori della proteasi (1 compressa) per prevenire la proteolisi.
   7. Centrifugare la sospensione per 30 minuti a 50.000 x g per rimuovere i detriti cellulari e applicare il surnatante su una colonna di trappola GST da 5 mL.
   8. Dopo aver lavato la colonna con 30 mL di PBS, eluire GST-FKBP51 e GST-FKBP52 con 5 mL di 10 mM di glutatione in PBS.
   9. Concentrare le proteine su un'unità di centrifugazione da 15 mL 10.000 MWCO. Per rimuovere il glutatione libero, passare i concentrati attraverso la colonna PD-10 bilanciata con 0,5x PBS e concentrarsi nuovamente sul dispositivo di centrifugazione con filtro.
   10. Raccogli le frazioni contenenti proteine. Verificare le proteine in SDS-PAGE e regolare le concentrazioni proteiche a 1 mg/mL.
       nota: La resa proteica tipica è di 2-5 mg/L di coltura. La proteina può essere conservata a -20 °C.

2. Accoppiamento del peptide C-terminale Hsp90 alle perle accettori (Figura 1B)

1. Preparazione del peptide Hsp90
   1. Sintetizzare dieci peptidi aminoacidici NH 2-EDASRMEEVD-COOH corrispondenti agli amminoacidi 714-724 dell'isoforma umana Hsp90 beta (UniProt ID: P08238) mediante un servizio di sintesi peptidica.
   2. Diluire il peptide Hsp90 in PBS alla concentrazione di 1 mg/mL.
2. Preparazione perle accettori
   1. Diluire le perle accettori non coniugate in PBS a una concentrazione di 1 mg/mL e trasferirle in una provetta da 1,5 mL.
   2. Eseguire il lavaggio per centrifugazione a 16.000 x g per 15 min. Rimuovere con cura il surnatante.
3. coniugazione
   1. Impostare il rapporto tra le perle e il peptide su 10:1. Nella provetta da 1,5 mL contenente 1 mg di pellet di perlina accettore (preparata come descritto sopra), aggiungere 1 mL di PBS (pH 7,4), 0,1 mg di peptide diluito, 1,25 μL di Tween-20, 10 μL di una soluzione da 400 mM di cianoboroidruro di sodio (NaBH₃CN) in acqua.
      cautela: NaBH₃CN è tossico; Utilizzare una cappa aspirante e guanti. La soluzione di NaBH₃CN deve essere preparata al momento.
   2. Incubare per 24 ore a 37 °C con agitazione end-over-end (10-20 giri/min) su un agitatore rotante.
4. Tempra di reazione e lavaggio delle perle
   1. Aggiungere 20 μl di soluzione 1 M di Tris-HCl (pH 8,0) alla reazione per bloccare i siti non reagiti. Incubare per 1 ora a 37 °C.
   2. Centrifugare a 16.000 x g (o velocità massima) per 15 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di microsfere in 1 mL di soluzione di Tris-HCl (100 mM, pH 8,0).
   3. Ripetere la fase di lavaggio tre volte.
   4. Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere le perle a 1 mg/mL in tampone di conservazione (1 mL di 0,5 × PBS con sodio azide allo 0,01% come conservante). Conservare la soluzione di perlina accettore coniugata a 4 °C al riparo dalla luce.
      cautela: L'azoturo di sodio è tossico; Utilizzare una cappa aspirante e guanti.

3. Il test che sonda l'interazione tra GST-FKBP51 o GST-FKBP52 e il peptide C-terminale Hsp90 e l'inibizione con composti di piccola massa molecolare (Figura 1C)

1. Proteine marcate con GST che interagiscono con le perle donatrici di glutatione
   1. Impostare le reazioni in piastre a 384 pozzetti.
   2. Preparare la soluzione contenente 10 μg/mL di perle donatrici di glutatione in 0,5x PBS, pH 7,4,
      nota: Dopo una conservazione prolungata, le perle si depositano e devono essere fatte vorticare.
   3. Aggiungere GST-FKBP51 o GST-FKBP52 a una concentrazione finale di 10 μg/mL.
   4. Incubare al buio a 25 °C per 10 min.
      nota: In questa fase, le proteine marcate con GST interagiranno con il glutatione attaccato alle perline. Per ogni pozzetto verranno utilizzati 22,5 μl di questa miscela. La concentrazione dei partner vincolanti deve essere determinata empiricamente. Titolare GST-FKBP51 e GST-FKBP52 e scegliere la concentrazione che fornisce il segnale migliore.
2. Aggiunta di composti
   1. Effettuare diluizioni seriali dei composti in esame in DMSO.
      nota: Le concentrazioni utilizzate sono tipicamente 10, 30, 100, 300, 1.000 e 3.000 μM.
   2. Aggiungere 0,25 μL di DMSO (controllo negativo) o peptide C-terminale Hsp90 (controllo positivo, 30 μM) o composti in DMSO all'angolo di ciascun pozzetto della piastra. Utilizzare triplicati per ogni concentrazione di composto.
   3. Aggiungere 22,5 μl della soluzione contenente perle donatrici di glutatione con proteine marcate con GST in ciascun pozzetto.
   4. Agitare delicatamente la piastra con le mani ma accuratamente. Incubare al buio a 25 °C per 15 min.
      nota: Durante questo periodo, i composti interagiranno con il dominio TPR nel sito di legame del peptide C-terminale Hsp90.
3. Aggiunta perline accettore
   1. Diluire le perle accettori con il peptide C-terminale Hsp90 attaccato a 100 μg/mL in 0,5x PBS.
   2. Aggiungere 2,25 μl di perle accettori diluite in ciascun pozzetto.
   3. Mescolare delicatamente ma accuratamente. Incubare al buio a 25 °C per 15 min.
      nota: In questa fase, le perle donatrici e accettori vengono messe in prossimità dalle interazioni proteina-peptide. Il volume finale della miscela di reazione è di 25 μl. Pertanto, le concentrazioni finali dei composti variano da 0,1 a 30 μM.
4. Lettura targa
   nota: Leggere la targa utilizzando un lettore di lastre impostato nella relativa modalità.
   1. Accendi lo strumento e apri il software
   2. Scegli il protocollo pertinente.
   3. Fare clic su Modifica mappa piastra e selezionare il pozzo utilizzato nella piastra per la misurazione.
   4. Fare clic su Avanti per continuare ed eseguire il protocollo selezionato.
   5. Dopo la misurazione, fare clic su Mostra risultati per visualizzare i risultati.
   6. Esportare i dati.

Tabella 1: Reazione PCR impostata per l'amplificazione del DNA umano FKBP51 e FKBP52.

Componente di reazione	Volume (μL)
Tampone PCR (5 x concentrato)	4
Innesco in avanti	1
Innesco inverso	1
plasmide	0,5
Miscela dNTP (10 mM ciascuna)	0,5
Phusion DNA polimerasi	0,5
Acqua (grado DNA)	12.5
totale	20

Tabella 2: Condizioni del termocilindro per l'amplificazione del DNA umano FKBP51 e FKBP52.

Palco	Temperatura (°C)	Ore	Cicli
Denaturazione iniziale	94	3 minuti	1
denaturazione	94	30 secondi	35
ricottura	56	30 secondi
estensione	72	1 minuto
Estensione finale	72	5 minuti	1
Nota: La temperatura del coperchio è di 105 °C.

Risultati

Figura 1: Schema di questo protocollo. (A) Espressione e purificazione di GST-FKBP51 e GST-FKBP52. (B) Accoppiamento del peptide C-terminale Hsp90 alle perle accettori. (C) Il test che sonda l'interazione tra GST-FKBP51 o GST-FKBP52 e il peptide C-terminale Hsp90. Inibizione con composti di piccola massa molecolare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre a 384 pozzetti	Perkin Elmer	6008350	Volume del saggio 25 ml
Unità di centrifugazione Amicon 10.000 MWCO	Millipore	UFC901008	Proteine concentrate
ampicillina	sigma	Codice A0166	antibiotici
Agitatore di batteri Unimax 1010	Heidolph		Batteri di coltura
cloni di cDNA per FKBP51 umano	Fonte: BioScience	ID clone: 5723416	vettore pCMV-SPORT6
cloni di cDNA per FKBP52 umano	Fonte: BioScience	ID clone: 7474554	vettore pCMV-SPORT6
E. coli chimicamente competente	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Dmso	Supelco	Codice 1.02952.1000	Composti diluiti
DPBS	Gibco	Codice 14190-144	Preparare la soluzione
Edta	Calbiochem	344504	Prevenire la proteolisi durante la sonicazione
glutatione	sigma	G-4251	Eluire le proteine marcate con GST
Perline donatrici di glutatione	Perkin Elmer	Codice 6765300	Perlina donatrice
Colonna trappola GST	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purificare le proteine marcate con GST
Isopropil-β-D-tiogalattoside	Thermo Fisher Scientifico	R0392	Induce l'espressione proteica
LB Brodo (Miller)	sigma	L3522	Terreno di crescita microbico
Strumento PCR	BIO-RAD	Termociclatore S1000	Amplificazione/PCR
Colonna PD-10	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Sostituzione della soluzione
vettore pGEX-6P-1	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	plasmide
pGEX-6P-2 vettoriale	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	plasmide
Lettore di lastre	Perkin Elmer	Lettore multietichetta EnSpire 2300	Leggi la piastra alfa
Software per lettori di lastre	Perkin Elmer	Gestore EnSpire	Software per lettori di lastre
Protocollo software per lettore di piastre	Perkin Elmer	Alfa 384 pozzetti Basso volume	Utilizzare questo protocollo per leggere la piastra
PMSF	sigma	P7626	Prevenire la proteolisi durante la sonicazione
cocktail di inibitori della proteasi	sigma	S8830	Prevenire la proteolisi durante la sonicazione
Aziduro di sodio	sigma	Episodio 2002	Come conservante
Cianoboroidruro di sodio (NaBH3CN)	sigma	156159	Attiva la matrice per l'accoppiamento
Dieci peptidi di aminoacidi NH2-EDASRMEEVD-COOH corrispondenti agli amminoacidi 714-724 dell'isoforma umana Hsp90 beta	Peptide 2.0 inc		Sintetizzare il peptide C-terminale Hsp90
Rotatore per provette	LABINCO		Effettuare un'agitazione end-over-end
Tris-HCl	sigma	10708976001	Bloccare i siti non reagiti delle perle accettori
Interpolazione-20	sigma	P1379	Prevenire l'aggregazione delle perle
Ultra centrifuga Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuga per ottenere pellet di cellule batteriche
Disgregatore cellulare ad ultrasuoni	Microson		Sonicare le cellule per rilasciare proteine
Perle accettori non coniugate	Perkin Elmer	6762003	Perline accettori
Modulo XCell SureLock Mini-Cell e XCell II Blot	Invitrogen	EI0002	PAGINA SDS