1. Semina delle cellule Vero
- Il giorno prima di iniziare il test della placca, tripsinizzare le cellule Vero e risospenderle nel normale Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) e integrare secondo la metodologia standard di coltura cellulare. Risospendere le cellule tripsinizzate in 10 mL di DMEM per pallone T-75 delle cellule Vero confluenti (~107 cellule).
NOTA: Il DMEM viene utilizzato per i saggi della placca al posto dell'alfa-MEM perché rallenta leggermente il tasso di crescita cellulare e favorisce migliori risultati del saggio della placca.
- Contare le cellule con il metodo preferito (ad esempio, un emocitometro standard con esclusione di Trypan Blue).
- Seminare le cellule a 4 x 106 cellule/piastra; per l'HSV-2, utilizzare piastre a 6 pozzetti con 2,5 mL di DMEM (con supplementi) per pozzetto; e per l'HSV-1, utilizzare piastre a 12 pozzetti con 1,25 mL di DMEM (con supplementi) per pozzetto.
NOTA: Il numero di cellule deve essere costante indipendentemente dalla piastra utilizzata, anche se la dimensione dei pozzetti è importante per quanto riguarda l'accuratezza del test della placca. È essenziale ottenere una distribuzione uniforme delle cellule, che può essere ottenuta in modo più efficace muovendo la piastra avanti e indietro, non in modo circolare.
- Lasciare che le cellule crescano per una notte a 37 °C/5% di CO2 in un incubatore umidificato.
NOTA: L'umidità viene mantenuta con una pentola di acqua distillata contenente un alghicida sul fondo dell'incubatrice.
2. Diluizione del campione
- Completare la diluizione del campione e l'aggiunta del virus alle cellule in un'unica sessione di laboratorio.
ATTENZIONE: Gli HSV-1 e -2 sono infettivi per l'uomo e devono essere maneggiati in un adeguato contenimento di biosicurezza (BSL-2). Tenere separati tutti i materiali che entrano in contatto con il virus e disinfettarli con un agente quaternario a diluizione 1/256 (vedere la Tabella dei materiali), iodoforo, candeggina o detergente ionico forte (ad es. SDS) prima di rimuoverli dalla cabina di biosicurezza.
- Il giorno dopo la semina delle cellule Vero, diluire in serie ogni campione di virus da placcare in 1x PBS; in genere utilizzare diluizioni di 10 volte per il tracciamento più preciso.
- Effettuare queste diluizioni attraverso 10-4 (per basse concentrazioni di virus) o attraverso 10-9 (per le aspettative di campioni di titolo più elevati) con almeno 1 mL di ciascun campione rimanente per il test della placca stesso.
- Conservare tutte le diluizioni virali in ghiaccio (non più di 1 ora) fino al momento di aggiungere questi campioni di virus diluiti alle cellule.
3. Aggiunta del virus alle cellule
- Rimuovere il terreno di coltura cellulare da uno o due pozzetti con una pipetta.
NOTA: Non utilizzare un aspiratore perché rimuove troppo liquido dal monostrato di celle e asciuga le cellule. Una considerazione cruciale è garantire che il monostrato cellulare rimanga idratato durante l'intero corso dell'esperimento. Se le celle si asciugano, laveranno via la piastra nella fase finale e genereranno dati inutilizzabili. Pertanto, elaborare solo uno o due pozzetti alla volta per ridurre questa possibilità.
- Aggiungere con cautela il campione di virus diluito (100-400 μL e 50-200 μL di campione virale vengono utilizzati rispettivamente per piastre a 6 e 12 pozzetti) goccia a goccia su ciascun monostrato, aggiungendo le gocce lungo il lato di ciascun pozzetto. Ripetere il processo per ogni uno o due pozzetti fino a riempire l'intera piastra con i campioni di virus da placcare.
NOTA: L'aggiunta delle gocce al centro del pozzetto può inavvertitamente staccare le cellule dal substrato.
- Scuotere delicatamente l'intera piastra a mano per assicurarsi che il PBS che contiene il virus copra l'intero monostrato di cellule in ciascun pozzetto, quindi posizionare la piastra in un incubatore di CO2 a 37 °C per consentire al virus di assorbirsi.
- Ogni 10 minuti entro 1 ora, rimuovere la piastra dall'incubatrice, farla oscillare delicatamente di nuovo per diffondere il virus in modo più uniforme su ciascun pozzetto, quindi rimetterla nell'incubatrice.
NOTA: Ogni esperimento determinerà il numero di repliche e quali diluizioni vengono utilizzate; La preferenza del lettore detta quella decisione.
- Per ridurre la possibilità di contare inavvertitamente l'inoculo non assorbito, rimuovere il campione di virus dai pozzetti con puntali per pipette da 1000 μl e metterlo in un becher di scarto.
NOTA: Anche in questo caso, questa procedura viene eseguita con solo uno o due pozzetti alla volta per mantenere l'idratazione del monostrato cellulare.
- Posizionare 2,5 mL di un overlay di metilcellulosa (sciogliere il 5% di metilcellulosa p/p in 100 mL di PBS, sterilizzare in autoclave per 15 min a 121 °C e 15 psi in un ciclo liquido, quindi aggiungere 375 mL di DMEM più 25 mL di FBS).
- Una volta che l'intera piastra contiene il rivestimento, riposizionare la piastra nell'incubatrice per consentire la crescita per due giorni.
NOTA: Se il virus e le cellule vengono lasciati crescere per tre giorni, anche con DMEM più integratori, può verificarsi una perdita sostanziale di cellule nel monostrato, compromettendo così i dati finali.
- Disinfettare il becher di scarto, in genere con l'aggiunta di candeggina, uno iodoforo o un virucida simile, prima di rimuoverlo dalla cabina di biosicurezza.
4. Colorazione per placche
- Dopo i due giorni di incubazione, rimuovere la copertura di metilcellulosa con una pipetta, di nuovo uno o due pozzetti alla volta, e metterla in un becher di scarto.
- Aggiungere ~2 mL di cristallovioletto all'1% (vedi Tabella dei materiali) in etanolo al 50% a ciascun pozzetto per colorare le placche.
NOTA: Non è indispensabile rimuovere fino all'ultima goccia della sovrapposizione.
- Incubare la piastra con tutti i pozzetti riempiti con il colorante per 30 minuti a 37 °C. A questo punto, disinfettare il becher dei rifiuti come sopra al punto 3.8.
- Lavare energicamente le piastre con acqua di rubinetto fino a quando il deflusso non è limpido.
NOTA: Un getto d'acqua dolce non è abbastanza vigoroso; È necessaria la piena pressione da un dispositivo di lavello da laboratorio.
- A questo punto, assicurati che ci siano differenze di circa 10 volte nel numero di placche in ciascuna serie di diluizione.
- Lasciare asciugare le piastre per una notte a testa in giù, dopodiché si possono contare le singole placche.
