Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Saggio TUNEL
- Eutanasia degli animali che mostrano segni clinici di chitridiomicosi e di un numero uguale di animali di controllo Bd-negativi.
- Sezionare i campioni di pelle (dorsale, ventrale e coscia) da ciascun animale. Fissare i campioni di pelle per 2 ore in formaldeide tamponata con fosfato al 4% v/v. Il tempo di fissazione breve e costante consente di fissare completamente i tessuti, ma consente anche una colorazione immunoistochimica efficace e accurata. Quindi trasferire all'80% di etanolo fino all'inclusione per il sezionamento.
- Incorporare la pelle in cera di paraffina per la preparazione istologica seguendo i metodi standard. In sintesi, il protocollo è il seguente:
- Disidratare i tessuti in una serie graduata di etanolo ed eliminare l'etanolo con xilene. Incorporare il tessuto nella cera di paraffina e posizionare tutti e tre i campioni di pelle per ogni individuo in un blocco di paraffina.
- Sezionare la pelle utilizzando un microtomo seguendo la preparazione istologica standard. Sezionare il tessuto in serie a 5 μm e quindi fissarlo su vetrini idrofili. Posizionare quattro istosezioni seriali per tipo di pelle per vetrino. Realizza tre vetrini per individuo con sezioni cutanee seriali, ricorda che ogni vetrino ha quattro sezioni di ciascun tessuto attaccate.
- Colorare i vetrini nel seguente ordine:
- Colorare il primo vetrino con ematossilina seguito da controcolorazione con eosina (H&E). Questa diapositiva serve a visualizzare la posizione degli sporangi Bd all'interno della pelle.
- Colorare il secondo vetrino dopo un test TUNEL disponibile in commercio per la preparazione istologica e seguire le istruzioni del produttore, descritte di seguito.
- Innanzitutto, deparaffinare le sezioni di tessuto in un barattolo di coplin lavando i vetrini con tre cambi di xilene per 5 minuti per lavaggio e seguire con due cambi di etanolo al 100% per 5 minuti per ogni lavaggio. Seguire con un lavaggio di etanolo al 95% per 3 minuti e poi etanolo al 70% per 3 minuti. Terminare con un lavaggio di PBS per 5 minuti.
- Pretrattare il tessuto con l'enzima di digestione delle proteine appena diluito (proteinasi K a una concentrazione di 20 μg/mL diluita in PBS) e aggiungere direttamente al vetrino. Lasciare incubare per 15 minuti. Lavare con due cambi di PBS in un barattolo di coplin per 2 minuti ciascuno.
- Picchiettare il liquido in eccesso e sfumare con perossido di idrogeno al 3,0% in PBS in un barattolo di coplin per 2 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare due volte con PBS, per cinque minuti ogni lavaggio.
- Eliminare il liquido in eccesso, quindi applicare 75 μl/5 cm2 di tampone di equilibrio direttamente sul tessuto del vetrino. Incubare per 10 s. Eliminare il liquido in eccesso intorno alla sezione e applicare 55 μL/5cm2 di enzima deossinucleotidiltransferasi (TdT) terminale funzionante. Incubare in camera umidificata per 1 ora a 37 °C.
- Dopo l'incubazione TdT, mettere il vetrino in un barattolo di coplin di tampone di arresto/lavaggio della forza di lavoro, agitare per 15 s e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare il vetrino con tre cambi di PBS per 1 minuto per lavaggio. Elimina il liquido in eccesso.
- Applicare sul tessuto il coniugato anti-digossigenina (rodamina) che è stato riscaldato a temperatura ambiente, 65 μL/5 cm2. Incubare in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente ed evitare l'esposizione alla luce. Lavare con quattro cambi di PBS per 2 minuti per lavaggio. Elimina il liquido in eccesso.
- Terminare aggiungendo 15 μL di 0,5 - 1 μg/mL di DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo) nel terreno di montaggio del vetrino al vetrino, che funge da controcolorante. Quindi coprire con un vetrino coprioggetti e sigillare con smalto per unghie o cemento di gomma. Lasciare asciugare i vetrini al buio poiché il test è sensibile alla luce.
- Colorare il terzo vetrino utilizzando il test TUNEL e il colorante di contrasto DAPI, ma utilizzare come controllo positivo e negativo per ogni campione.
NOTA: Delle 4 istosezioni sui vetrini di controllo, le prime 2 sono repliche di controllo positive e le ultime 2 sono repliche di controllo negative.
- Per i controlli positivi, invece del passaggio 1.5.2.2, pretrattare il tessuto con tampone DN (30mM trizma base, pH 7.2, 4mM MgCl2, 0.1mM DDT) e lasciare incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Quindi sciogliere la Dnase I nel tampone DN per una concentrazione finale di 0,1ug/mL e applicarla direttamente sul vetrino. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare il vetrino con 5 lavaggi di dH2O per 3 minuti ciascuno. Asciugare il liquido in eccesso. Quindi riprendere il test TUNEL come indicato al paragrafo 1.5.2.3.
- Per i controlli negativi, non aggiungere l'enzima deossinucleotidiltransferasi terminale (TdT) a tali campioni (come descritto nel paragrafo 1.5.2.4).
2. Osservare i vetrini TUNEL immediatamente dopo il completamento del test.
- Scatta foto a intervalli casuali lungo ogni sezione della pelle a 200X utilizzando un microscopio a fluorescenza, utilizzando filtri sia per la colorazione di rodamina, che rivela le cellule apoptotiche e appare rossa, sia per DAPI che rivela tutti i nuclei e appare blu, in modo da poter generare una sovrapposizione di cellule. Assicurarsi che vengano fotografate almeno 100 cellule per sezione di pelle per campione. Conservare i vetrini in una scatola per microscopio al buio a -20 °C.
- Conta le celle (colorate DAPI blu) per immagine. Assicurarsi che vengano contate almeno 100 cellule per sezione cutanea. Per raggiungere 100 celle, conta tutte le celle all'interno dell'immagine. Se in un'immagine sono presenti meno di 100 cellule, contare un'altra immagine fino a raggiungere almeno 100 cellule per sezione di pelle per animale.
- Quindi, conta il numero di cellule TUNEL-positive nelle stesse immagini (colorate con rodamina rossa). Le cellule TUNEL-positive, che indicano l'apoptosi e non la necrosi o il fondo, sono cellule singole con bordi cellulari chiari (le membrane sono intatte senza lisi). A volte le cellule si restringono per formare corpi apoptotici.
- Individuare le aree contate nel test TUNEL e analizzare le regioni corrispondenti sulle istosezioni colorate H&E. Verificare che le sezioni colorate con H&E corrispondano ai siti di infezione da Bd, il che garantisce che i siti infetti da Bd vengano utilizzati durante il conteggio delle cellule apoptotiche nel test TUNEL.
