Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Allevamento e monitoraggio degli animali
- Ospita gli animali individualmente, in un ambiente appropriato per la specie, con un programma di acqua, alimentazione e pulizia adeguati. Controlla gli animali ogni giorno.
- Utilizzare individui adulti della Litoria verreauxii alpina minacciata (per il saggio Caspase 3/7, Sezione 4), donati da strutture di riproduzione in cattività. Mantenere gli animali a 15 - 18 °C, su un substrato di muschio e ghiaia, nebulizzarli quotidianamente con acqua ad osmosi inversa e nutrirli 3 volte alla settimana con grilli carichi di intestino.
- Raccogli i dati su ogni individuo una volta alla settimana. Tamponare gli individui per la Bd come descritto nel passaggio 2.1. Pesare ogni animale fino a circa 0,1 g utilizzando una bilancia e misurare la lunghezza del muso allo sfiato (SVL) con l'approssimazione di 0,01 mm utilizzando un calibro a quadrante.
- Dopo l'inoculazione (come descritto nel paragrafo 3), controllare quotidianamente gli animali per verificare la presenza di segni clinici di infezione (desquamazione irregolare della pelle, inappetenza, arrossamento delle gambe, letargia o riflesso raddrizzante ritardato) in conformità con le linee guida sull'etica animale. Sopprimere gli animali se sono presenti segni clinici e morbilità.
- Eutanasia con un sovradosaggio di tricaina metansolfonato (MS222) (0,1% p/v MS222 a pH 6 - 7 con bicarbonato di sodio in acqua di rubinetto invecchiata). Tenere gli animali in MS222 per 10 minuti dopo che tutti i movimenti cessano e non mostrano alcuna risposta agli stimoli.
2. Test per l'infezione da Bd
- Tampone per Bd
- Tamponare ogni animale con un nuovo tampone sterile di rayon (un tampone per animale). Utilizzare il seguente metodo di tampone: cinque volte sul ventre e cinque volte su ciascuna coscia, lato e arto. Questo è un totale di 45 colpi.
- Ruotare delicatamente il tampone durante e tra una corsa e l'altra per garantire un'efficace cattura del DNA. Rompere la punta del tampone in provette da microcentrifuga da 1,5 ml e conservare a -20 °C fino all'estrazione.
- Estrazione del DNA e test qPCR
- Estrarre il DNA genomico dai tamponi aggiungendo 50 μl di un reagente per l'estrazione del DNA disponibile in commercio con 30 - 40 mg di perle di silice da 0,5 mm. Battere i campioni in un disgregatore di celle a perlina alla massima velocità per 2 minuti. Seguendo la fase del battitore a sfere, centrifugare i campioni a 2.000 x g per 1 minuto.
- Incubare i campioni a 100 °C per 10 minuti e lasciarli raffreddare. Centrifugare i campioni a 5.000 x g per 3 minuti, quindi trasferire il surnatante in singole provette da microcentrifuga da 1,5 mL e conservarli a -20 °C fino alla qPCR.
- Utilizzare la PCR quantitativa (qPCR) seguendo Boyle et al. 2004 per analizzare il carico di infezione. Utilizzare le seguenti modifiche:
- Diluire i campioni di estrazione del DNA 6:100 con doppia acqua deionizzata. Aggiungere 0,7 μL di albumina sierica bovina (BSA) a ciascun pozzetto per aiutare a prevenire l'inibizione della PCR. Eseguire ogni campione in singlicate. Su ogni piastra utilizzare un controllo negativo (senza stampo) e un controllo positivo con una serie di standard di diluizione per stimare il carico di zoospore (infezione).
3. Inoculazione
- Cultura Bd
- Preparare il brodo di coltura aggiungendo 16 g di triptone, 2 g di idrolizzato di gelatina e 4 g di lattosio (TGHL) a 1 L di acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave (121 °C per 40 min) e lasciare raffreddare il brodo.
- Inoculare l'isolato di Bd (in questo caso, isolato dall'isolato del New South Wales, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, passaggio numero 11) in un brodo TGHL e far crescere per 7 giorni a 23 °C, quindi trasferire la coltura del brodo su piastre di agar TGHL.
- Per preparare i piatti, aggiungere 16 g di triptone, 2 g di gelatina idrolizzato, 4 g di lattosio (TGHL) e 10 g di agar batteriologico a 1 L di acqua deionizzata e autoclave (121 °C per 40 min). Una volta che la miscela è abbastanza fredda da poter essere toccata, ma prima che si solidifichi, versare l'agar TGHL in piastre di coltura di 92 mm di diametro in modo che siano piene da 1/4 a 1/3, in una cappa di sicurezza biologica di Classe II.
- Quando l'agar si è solidificato e raffreddato completamente, inoculare in ogni piastra 0,5 ml di Bd dal brodo liquido e distribuire uniformemente. Lasciare asciugare la miscela di brodo Bd su un piatto per circa 1 ora e poi sigillare i piatti con un film di paraffina di plastica. Incubare le piastre con il lato agar rivolto verso il basso a 23 °C per 5 - 7 giorni.
- Piastre di allagamento per soluzione di inoculazione di zoospore
- Controllare la motilità delle zoospore al microscopio ottico invertito per garantirne la vitalità ogni giorno prima dell'inoculazione. Quando il rilascio di zoospore è elevato, con molte zoospore che nuotano al di fuori degli sporangi, la coltura è pronta per l'inoculazione.
- Inondare ogni piastra con 3 ml di acqua di rubinetto invecchiata o di acqua di laghetto artificiale, versando l'acqua nella piastra e incubando a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire alle zoospore di rilasciarsi nell'acqua. Dopo il periodo di incubazione, decantare la sospensione di zoospore in un nuovo contenitore sterile.
- Stimare la concentrazione di zoospore seguendo le istruzioni del produttore utilizzando un emocitometro. Una volta nota la concentrazione della sospensione di zoospore, diluire la sospensione a una concentrazione di 1 x 106 zoospore per 3 ml con acqua di rubinetto invecchiata.
- Inoculare gli animali
- Inoculare ogni animale versando 3 ml di miscela di inoculo sul suo ventre in contenitori individuali da 50 ml. Lasciare che l'inoculo in eccesso si raccolga nella base del contenitore di inoculazione. Lasciare ogni animale in un contenitore di inoculazione individuale per 24 ore per garantire l'infezione e, dopo l'inoculazione di 24 ore, riportare ogni individuo in un terrario disinfettato.
- Disinfettare i terrari utilizzando una soluzione di candeggina commerciale al 13% in volume/volume (v/v), risciacquare almeno due volte con acqua, quindi lasciare asciugare per non meno di 24 ore.
- Per i controlli Bd-negativi, simulare l'inoculazione degli animali utilizzando gli stessi metodi dei punti 3.2 - 3.3, ma inondare le piastre di agar prive di Bd con 5 ml di acqua di rubinetto invecchiata invece delle piastre di agar inoculate con Bd.
4. Saggio della caspasi 3/7
- Raccogliere le punte delle dita dei piedi da ciascun animale (sia Bd- esposto che Bd-negativo) una volta alla settimana fino alla settimana 3 dopo l'inoculazione e ogni due settimane fino alla fine dell'esperimento, fino a 8 dita per individuo.
- Tagliare la punta della punta della seconda falange con forbici sterilizzate a fiamma, metterla in una microprovetta da 1,5 mL e congelare immediatamente a -80 °C.
- Estrarre le proteine da un campione di dita congelate.
- Posizionare i campioni in 100 μL di tampone per campioni (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) con due perle di acciaio inossidabile (3,2 mm) in una microprovetta con tappo a vite da 1,5 mL. Lisi i campioni con 4 cicli di 1 minuto di battitura del cordone alla massima velocità (nello stesso battitore di perline utilizzato al punto 1.2.1) seguiti da 3 minuti sul ghiaccio. Dopo la lisi, centrifugare i campioni a 12.000 x g e 4 °C per 5 minuti. Raccogliere il surnatante da utilizzare nel saggio.
- Quantificare la concentrazione di proteine per campione utilizzando il test Bradford.
- In una piastra a 384 pozzetti, mescolare 10 μl di estratto proteico con 10 μl di reagente Bradford e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. Eseguire ogni campione in duplicato, insieme a una serie di standard di diluizione BSA a 5 volte. Lettura dell'assorbanza a 595 nm su un lettore di piastre di assorbanza.
- In alternativa, se i campioni di punta delle dita sono troppo piccoli (la concentrazione proteica è vicina allo standard più basso determinato dal test di Bradford o se le rane campionate sono inferiori a 3 g di peso totale), standardizzare i campioni stimando la superficie della pelle utilizzando fotografie, invece del test di Bradford.
- Prima di estrarre le proteine dal campione per il test della caspasi, fotografare ogni dito del piede con un ingrandimento di 40X utilizzando un microscopio a luce invertita.
- Analizza il campione di dita utilizzando un software di imaging per computer, stimando l'area dell'alluce. A tale scopo, tracciare una linea attorno al bordo del fermapiede e fare in modo che il software di imaging stimi l'area all'interno della forma. Quindi moltiplica quell'area per pi greco (3,14), che approssima l'area superficiale del campione di pelle tridimensionale (poiché la lunghezza x l'area della sezione trasversale (pi x diametro) fornisce l'area della superficie esterna di un tubo).
- Eseguire il test della caspasi 3/7.
- In una piastra di luminescenza a 384 pozzetti, aggiungere 10 μl di reagente caspasi 3/7 disponibile in commercio e 10 μl di estratto proteico. Eseguire ogni campione in triplice copia.
- Mescolare i reagenti agitando lentamente la piastra per 15 s. Incubare la piastra al riparo dalla luce per 30 minuti a temperatura ambiente. Misura la luminescenza utilizzando un lettore di piastre luminescenti.
