Il test di fagocitosi: una tecnica di immunocolorazione per visualizzare l'inghiottimento delle cellule apoptotiche nelle cellule embrionali di Drosophila melanogaster

Abstract

Fonte: Nonaka, S. et al. Saggio di fagocitosi per cellule apoptotiche in embrioni di Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video mostra una tecnica di immunocolorazione per visualizzare l'inghiottimento di cellule apoptotiche nelle cellule embrionali omogeneizzate di Drosophila melanogaster. Questo metodo fornisce informazioni sulla fisiologia cellulare determinando l'entità dell'inghiottimento delle cellule apoptotiche.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Colorazione degli emociti

1. Immunocolorazione con un anticorpo anti-Croquemort
   1. Immergere in serie i vetrini in metanolo per 10 minuti, in PBS contenente lo 0,2% (v/v) di Triton X-100 per 10 minuti e poi in PBS per 10 minuti.
   2. Montare 20 μl di siero di suino intero al 5% (v/v) in PBS contenente lo 0,2% (v/v) di Triton X-100 sulle cellule per il blocco. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 20 min.
   3. Rimuovere la soluzione dai vetrini e montare sulle cellule 20 μL di antisiero anti-Croquemort (0,1% (v/v)) in PBS contenente 0,2% (v/v) di Triton X-100. Incubare i vetrini a 4 °C per una notte.
   4. Immergere i vetrini in PBS contenente lo 0,2% (v/v) di Triton X-100 per 10 minuti 5 volte.
   5. Immergere i vetrini in PBS per 10 minuti.
   6. Montare 20 μL di IgG anti-ratto marcate con fosfatasi alcalina (0,5% (v/v)) in PBS contenente lo 0,2% (v/v) di Triton X-100 e il 5% (v/v) di siero intero di suini su cellule a temperatura ambiente per 1 ora.
   7. Immergere i vetrini in PBS contenente lo 0,2% (v/v) di Triton X-100 per 10 minuti 5 volte.
   8. Immergere i vetrini in un tampone contenente 100 mM di Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM di NaCl e 50 mM di MgCl2 per 10 minuti.
   9. Mount soluzione di substrato della fosfatasi contenente 0,23 mg/mL di 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP), 0,35 mg/mL di nitro blu tetrazolio (NBT), 100 mM di Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM di NaCl e 50 mM di MgCl₂ sulle cellule.
   10. Osservare le cellule al microscopio per una corretta colorazione. Quando compaiono forti segnali viola nei granuli degli emociti, rimuovere la soluzione del substrato e immergere i vetrini in un tampone composto da 10 mM di Tris-HCl, pH 8,5 e 1 mM di EDTA. Si consiglia di colorare per circa 5 - 10 minuti.

2. Colora le cellule apoptotiche di TUNEL

1. Immergere i vetrini in PBS per 5 minuti.
2. Ripeti con il nuovo PBS.
3. Montare il tampone di equilibratura (vedi tabella dei materiali) sulle celle per 10 min.
4. Rimuovere la soluzione dai vetrini e montare 20 μL di soluzione TdT contenente 5 μL di desossinucleotidiltransferasi terminale e 15 μL di tampone di reazione sulle cellule a 37 °C per 1 ora.
5. Rimuovere la soluzione dai vetrini e immergerli in un tampone composto da 0,5 mL di tampone STOP/Wash e 17 mL di acqua.
6. Immergere le diapositive in PBS per 5 minuti 3 volte.
7. Montare 20 μL di Anti-Digossigenina-Perossidasi su cellule a temperatura ambiente per 30 minuti.
8. Immergere i vetrini in PBS per 5 minuti 4 volte.
9. Immergere i vetrini in una soluzione di substrato di perossidasi costituita da 30 mL di 50 mM di Tris-HCl, pH7,5 contenente una micro spatola completa di 3,3'-diaminobenzidina tetraidricloruro (DAB) e 0,002% (v/v) H₂O₂ per 30 s.
10. Ripetere il passaggio precedente fino a quando le cellule apoptotiche non sono colorate di marrone. Immergere i vetrini in acqua per fermare la reazione della perossidasi.
11. Racchiudere le celle con acqua per l'osservazione.

3. Misura il livello di fagocitosi delle cellule apoptotiche

1. Osservare i campioni al microscopio ottico per valutare il livello di fagocitosi. Conta le cellule Croquemort-positive o le cellule GFP-positive come emociti, le cellule TUNEL-positive come cellule apoptotiche e le cellule doppiamente positive come emociti fagocitori.
2. L'indice fagocitario è definito come il numero di cellule doppie positive rispetto al numero totale di cellule Croquemort-positive o cellule GFP-positive. Si raccomanda di osservare più di 300 emociti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
siero di suino intero	MP Biomedicali	Codice: 55993	Per il blocco
Kpl IgG anti-ratto (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	anticorpo secondario per emociti stainig con un anticorpo anti-Croquemort
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato	Roche	11383221001	BCIP, Per la colorazione degli emociti
nitro blu tetrazolio	Roche	11383213001	NBT, Per la colorazione di emociti
Anticorpo anti-Croquemort			descritto in precedenza in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Kit per il rilevamento dell'apoptosi in situ della perossidasi Apop Tag	Millipore	S7100	Per la colorazione di cellule apoptoittiche. Questo kit include il tampone di equilibrio, il tampone di reazione, il tampone STOP/lavaggio, l'enzima TdT e l'anti-digossigenina-perossidasi.
3,3'-diaminobenzidina tetraidricloruro	nacalai tesque	Codice 11009-41	DAB, Per la colorazione di cellule apoptoitche